FOXK1 interaction with FHL2 promotes proliferation, invasion and metastasis in colorectal cancer

doi:10.1038/oncsis.2016.68

.2016年11月28日；5（11）：e271。

doi:10.1038/oncsis.2016.68。

FOXK1与FHL2相互作用促进结直肠癌的增殖、侵袭和转移

M Wu先生¹, J Wang（王）¹, W Tang女士¹, X詹², Y李¹, Y Peng先生¹, X黄¹, Y Bai（Y白）¹, J Zhao（赵）^三, A李¹, C陈¹, Y Chen先生¹, H Peng先生⁴, Y Ren先生¹, G Li公司⁵, S刘¹, J Wang（王）¹

附属公司

¹广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，中国。
²南方医科大学南方医院生殖医学中心，中国广州。
^三中国广州南方医科大学南方医院风湿科。
⁴南方医科大学公共卫生与热带医学院病原生物学系，广州，中国。
⁵中国广州南方医科大学南方医院普外科。

PMID： 27892920
预防性维修识别码： PMC5141290型
DOI（操作界面）： 10.1038/oncsis.2016.68

FOXK1与FHL2相互作用促进结直肠癌的增殖、侵袭和转移

M Wu先生等。肿瘤发生. 2016.

.2016年11月28日；5（11）：e271。

doi:10.1038/oncsis.2016.68。

作者

M Wu先生¹, J Wang（王）¹, W Tang女士¹, X战², Y李¹, Y Peng先生¹, X黄¹, Y Bai（Y白）¹, J Zhao（赵）^三, A李¹, C陈¹, Y Chen先生¹, H Peng先生⁴, Y Ren先生¹, G Li公司⁵, S刘¹, J Wang（王）¹

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¹广东省胃肠病学重点实验室，南方医科大学南方医院消化科，广州，中国。
²南方医科大学南方医院生殖医学中心，广州，中国。
^三中国广州南方医科大学南方医院风湿科。
⁴南方医科大学公共卫生与热带医学院病原生物学系，广州，中国。
⁵中国广州南方医科大学南方医院普外科。

PMID： 27892920
预防性维修识别码： PMC5141290型
DOI（操作界面）： 10.1038/oncsis.2016.68

摘要

转录因子Forkhead框k1（FOXK1）是FOX家族的成员。FOXK1的异常表达可能在肿瘤的发展中起重要作用。我们之前的研究表明，四个半LIM蛋白2（FHL2）是上皮-间充质转化（EMT）和侵袭的关键诱导剂。然而，FOXK1协同FHL2肿瘤增殖、EMT和转移的分子机制尚不明确。我们通过定量RT-PCR、western blot、免疫荧光和免疫组织化学（IHC）分析评估信使RNA（mRNA）和蛋白表达水平。利用短发夹RNA（shRNA）介导的体内外抑制作用评估结直肠癌（CRC）细胞的迁移和侵袭能力。我们发现，与匹配的正常组织相比，CRC中FOXK1的表达上调。FOXK1在CRC中与FHL2发生物理交互。此外，这两种蛋白的高表达水平与分化、淋巴结转移、AJCC分期和预后不良显著相关。此外，FOXK1在CRC细胞中的过度表达与EMT、侵袭和转移有关。然而，在FOXK1过度表达细胞中，siRNA-介导的FHL2阻遏逆转了EMT以及体外和体内的增殖和转移表型。这些数据表明，FOXK1和FHL2的共同表达通过EMT的诱导增强了细胞增殖和转移。因此，FOXK1和FHL2可能是CRC联合治疗的潜在靶点。

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数字

图1
FOXK1在人CRC组织中的表达较高。(一)的表达式模式*福克斯K1*正常组织和肿瘤组织中的mRNA。*福克斯K1*在GENT数据库（可在http://medical-genomics.kribb.re.kr/GENT/). 方框表示中位数以及第25和75个百分位；点表示异常值。红色方框代表肿瘤组织；绿色方框代表正常组织。红色和绿色虚线分别表示所有肿瘤和正常组织的平均值。星号表示*福克斯K1*与正常组织相比，结肠肿瘤中的表达。*福克斯K1*结肠组织mRNA表达：蓝色虚线。(b条)通过qRT-PCR在10对结肠癌（肿瘤）和匹配的非癌结肠组织（正常）中表达FOXK1。所有这些实验都重复了三次，得到了相同的结果。(**c（c）**)平均而言*福克斯K1*发现于肿瘤中，而非正常组织中(n个=10). ****对<0.001. (d日)在八个选定的案例中*福克斯K1*在肿瘤组织中通过免疫组织化学证实(n个=8). 标尺，200μm ind日.

图2
CRC细胞中FHL2和FOXK1蛋白之间的相互作用。(一)共聚焦显微镜下用Hoechst对SW480细胞中的FHL2和FOXK1进行双重染色。(b条)所示CRC细胞中FOXK1和FHL2表达的Western blotting分析。(**c（c）**)将PCI-flag-FHL2质粒转染SW480和SW620细胞。用抗旗帜抗体进行免疫沉淀，以免疫前正常小鼠免疫球蛋白G（nm-IgG）作为对照。用抗FOXK1抗体进行Western blotting。用指示的抗体检测IP印迹，以显示全细胞裂解物的输入。免疫沉淀；Wb，western blot。(d日)SW480和SW620细胞的细胞裂解物被抗FOXK1抗体或对照抗体正常兔免疫球蛋白G（nr-IgG）免疫沉淀。用抗FHL2抗体进行Western blotting。用指示的抗体检测IP印迹以显示输入。所有这些实验都重复了两到三次，结果相似。比例尺代表20μm in一.

图3
FHL2和FOXK1在大肠癌中的表达呈正相关。(一)通过IHC分析检测正常或癌性结直肠组织标本中FHL2（a和c）和FOXK1（b和d）的表达。这些数字代表了87名癌症和非癌症患者的结肠组织。使用正常小鼠IgG作为第一抗体（a和b）的同型对照。(b条)正常和癌性CRC组织中两种蛋白的平均得分****对正常组织和癌组织之间<0.001。(**c（c）**)对FHL2和FOXK1阳性染色进行量化，并进行Spearman相关分析****对<0.001. (d日)卡普兰-迈耶CRC患者总体生存分析。分别根据FHL2（a）、FOXK1（b）的表达状态以及FHL2和FOXK1（c）的联合表达状态进行生存分析。比例尺代表100μm in一.

图4
FOXK1和FHL2促进CRC细胞的增殖和EMT。(一)通过western blot分析检测FHL2在SW480细胞中的表达水平，这些细胞转染FOXK1过表达质粒，然后转染FHL2 siRNA或Scr siRNA作为阴性对照。(b条)通过转染FHL2 siRNA或Scr siRNA 48 h，对FOXK1的SW480稳定转染体进行EdU掺入试验****对<0.001. (**c（c）**)用相控显微镜分析了转染FHL2 siRNA或src siRNA的SW480细胞中稳定表达FOXK1的异常形态。(d日)在荧光显微镜下观察用罗丹明-鬼臼毒素染色48小时的SW480细胞，以确定F-肌动蛋白丝。(**e（电子）**)载体、FOXK1 src siRNA和FOXK1-FHL2-siRNA细胞中E-cadherin（红色）和vimentin（绿色）染色的免疫荧光和显微镜显示。(**（f）**)转染48 h后，western blot检测EMT生物标志物，包括E-cadherin、vimentin、Snail、MMP2、MMP9、FOXK1和FHL2。所有实验都重复了三到四次，结果相似。比例尺代表100μm inb条，20μm英寸**c（c）**和d日，10μm英寸**e（电子）**.

图5
FOXK1和FHL2的共表达与人CRC的转移表型相关。(一)在伤口愈合实验中，用活细胞显微镜对细胞进行分析。原始放大倍数，×10***对<0.01, ****对<0.001. (b条)载体、稳定的FOXK1转染体在48小时后转染FHL2 siRNA，细胞的侵袭能力下降****对<0.001. 实验至少重复了三次。(**c（c）**)淋巴结转移癌组织中FHL2和FOXK1表达的典型IHC图像。标尺，100μm inc（c）这些图片代表了三个具有相同结果的独立实验。

图6
FOXK1与FHL2协同促进肿瘤增殖和转移*体内试验。*(一)皮下注射SW480-Vector、SW480-FOXK1和SW480-FOXK1–FHL2-shRNA细胞的裸鼠肿瘤发生评估。注射后第30天拍摄图像。(b条)各组在接种肿瘤细胞5天后测量肿瘤大小**对<0.05, ****对<0.001，载体vs FOXK1和FOXK1vs FOXK1–FHL2-shRNA。(**c（c）**)FHL2敲除显著抑制FOXK1诱导的增殖（Ki-67****对<0.001，载体vs FOXK1和FOXK1vs FOXK1–FHL2-shRNA），肿瘤血管密度显著降低（CD105****对<0.001，通过IHC观察到载体vs FOXK1和FOXK1-FHL2-shRNA）。(d日)用指定的细胞对小鼠进行原位移植(n个每组＝3）。肺或肝转移灶的典型图像显示为蓝色虚线。(**e（电子）**)处死小鼠，用苏木精和伊红（H&E）对转移癌组织进行染色。(**（f）**)用qPCR检测E-cadherin在SW480细胞来源的肿瘤中的表达****对<0.001，矢量vs FOXK1；FOXK1与FOXK2-FHL2-siRNA。比例尺表示100μm inc（c）和200μm英寸d日.

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1. Wotton KR、Mazet F、Shimeld SM。犬齿海鞘（Scyliorhinus canicula）中Fox C、Fox F、Fox L1和Fox Q1基因的表达定义了Fox基因在脊椎动物发育中的古老和衍生作用。Dev Dyn 2008；237: 1590–1603.-公共医学
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