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.2016年12月；13(12):989-992.
doi:10.1038/nmeth.4046。 Epub 2016年10月31日。

新型红移荧光蛋白的同时双色荧光寿命成像

塔勒拉维夫 1, 本杰明·B·金 2, 朱骏 2 三, 艾米·林俊杰 2 三, 迈克尔·Z·林 2 三 4, 安田良惠 1
附属公司

新型红移荧光蛋白的同时双色荧光寿命成像

塔勒拉维夫等。 Nat方法. 2016年12月.

摘要

我们描述了一种针对双色荧光寿命成像（FLIM）优化的红移荧光共振能量转移（FRET）对。这一对利用了一种新开发的FRET供体，单体氰基可激发红色荧光蛋白（mCyRFP1），具有较大的斯托克斯位移和单指数荧光寿命衰减。当与基于EGFP的生物传感器一起使用时，这对新传感器能够同时成像正在经历结构可塑性的单个树突棘中两个信号分子的活动。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。CyRFP1的表征及GCaMP6的双重成像
（a） mCyRFP1、CyRFP2和mEGFP的归一化吸收光谱。虚线表示近似2p激发（920 nm）。（b） mCyRFP1、CyRFP2和mEGFP的归一化发射光谱。带点的矩形表示绿色和红色排放过滤器的传输。（c） HEK293细胞中共表达mEGFP和mCyRFP1的荧光寿命衰减曲线与实验仪器响应函数（IRF）符合单指数衰减。（d） 用2p显微镜观察转染CyRFP1和GCaMP6s的器官型海马切片中CA1锥体神经元的树突段。箭头所指的脊椎用2p谷氨酸开盖刺激。显示了未插拔前的图像、指示的未插拔脉冲数后64毫秒的图像以及最终未插拔后30秒的图像。（e） 图d中显示的在谷氨酸解封诱导的结构塑性过程中脊柱体积（Δ体积）变化以及GCamp6和CyRFP荧光比率（Δ比率）变化的量化。（f）体内转染GCaMP6s和CyRFP1的运动皮层2/3层神经元树突段的2p图像。顶部面板显示脊柱2中的钙自发升高。底部面板显示树枝状钙瞬态。合并、覆盖CyRFP1和GCaMP6图像。（g） 图f中两个脊髓和树突轴的绿-红荧光比率变化的时间进程。插图显示了CyRFP1荧光的时间历程。比例尺，2μm。
图2
图2。FLIM中mCyRFP1-mMaroon1 FRET对的表征
（a） mCyRFP1和mMaroon1的吸收和激发（例如，激发；em，发射）的归一化（标准）光谱。（b） 红移RhoA传感器RhoA–CyRM的主要负离子（DN）和组成活性变体的荧光寿命衰减曲线。（c）红移Cdc42传感器Cdc42–CyR2的示意图，以及表达传感器（WT）或主要负离子传感器（DN）的HEK293细胞的代表性荧光寿命图像或组成活性（CA）突变，通过2pFLIM获得。（d） Cdc42–CyRM突变体的结合分数（DN、WT和CA分别为80、50和59个细胞）。（e） RhoA–CyRM示意图和表达传感器（WT）或其DN或CA突变变体的HEK293细胞的代表性荧光寿命图像。（f） RyoA–CyRM突变体在HEK293细胞中表达的结合分数（DN、WT和CA分别为184、190和181细胞）。比例尺，20μm。误差线代表s.e.m。；统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较检验进行测量。
图3
图3。结构塑性下单个树突棘RhoA和CaMKII活化的FLIM同步测量
（a） 用于实验的CaMKII-alpha传感器（Green-Camuiα）和RhoA–CyRM的示意图。（b，c）用2pFLIM获得的器官型海马切片中CA1锥体神经元树突段RhoA（b）和CaMKII（c）激活的代表性荧光寿命图像。使用2p谷氨酸去盖法（用箭头标记）在单个脊柱中诱导结构可塑性。比例尺，2μm。（d） RhoA和CaMKII传感器在受刺激脊椎及其相邻树突轴（10个脊椎，8个神经元）脊柱结构可塑性期间荧光寿命的平均变化。（e） 在以下条件下，在同步CaMKII–RhoA成像期间，受激脊髓的瞬态（顶屏；CaMKIII为16–64 s，RhoA为16–76 s）和持续（底屏；20–30 min）荧光寿命变化的定量：对照，无细胞外Ca2+（无Ca2+），将Green-Camuiα替换为mEGFP–dimVenus融合（+mEGFP-dimVenus），并将RhoA–CyRM的受体替换为Cdc42–CyR的受体（+RhoA假受体）。（分别为10/8、10/8、7/6和8/6棘/细胞；误差条代表s.e.m.；使用单向方差分析和Dunnett多重比较测试测量统计差异）。
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