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.2016年10月10日；30(4):563-577.
doi:10.1016/j.cell.2016.09.005。

N-Myc诱导EZH2介导的转录程序驱动神经内分泌前列腺癌

艾蒂安·达登 1, 希米莎·贝尔特兰 2, 马泰奥·贝内利 三, 凯特琳·盖弗特 4, 阿德琳·伯杰 1, 洛雷达纳·普卡 5, 乔安娜·塞尔塔 6, 安德烈亚·斯博纳 7, 佐哈尔·努扎德 1, 特蕾莎·麦克唐纳 1, 辛西娅·张 1, 嘉诚苑 1, 董高 8, 于晨 9, 马丁·艾尔斯 10, Juan-Miguel清真寺 6, 布莱恩·德·罗宾逊 6, Olivier Elemento公司 11, 马克·鲁宾 12, 弗朗西丝卡·德米切利斯 13, 大卫·S·里克曼 14
附属公司

N-Myc诱导EZH2介导的转录程序驱动神经内分泌前列腺癌

艾蒂安·达登等。 癌细胞. .

摘要

从去势抵抗性前列腺癌（CRPC）向神经内分泌前列腺癌（NEPC）的转变已成为治疗抵抗性的重要机制。NEPC与MYCN（编码N-Myc）的过度表达和基因扩增有关。N-Myc是几种罕见的儿科肿瘤中已确定的癌基因，但其在前列腺癌进展中的作用尚不明确。结合基因工程小鼠模型和人类前列腺癌转录组数据，我们发现N-Myc过度表达导致低分化、侵袭性前列腺癌的发生，其分子结构与人类NEPC相似。这包括取消雄激素受体信号和诱导多囊抑制复合物2信号。总之，我们的数据证明N-Myc是NEPC的致癌驱动因素。

关键词：极光激酶A；EZH2；N-Myc；抗去势前列腺癌；基因工程小鼠；神经内分泌前列腺癌；前列腺癌类器官。

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数字

图1
图1。MYCN公司前列腺癌中的表达
答：。 MYCN公司34例良性前列腺、68例前列腺癌（PCa）、32例去势耐药前列腺癌（CRPC）和21例神经内分泌前列腺癌（NEPC）临床标本的mRNA水平。（***p值<2.17e-05，Wilcoxon检验）B。基因表达水平之间的皮尔逊相关系数MYCN公司CRPC或NEPC样本中的AR靶基因或NE标记基因；*p值<0.05。C、。核糖核酸就地杂交MYCN公司代表性CRPC、具有神经内分泌特征的CRPC中的RNA（插图：嗜铬粒蛋白A IHC）和NEPC病例。（原始放大倍数：H&E为20倍（比例尺=50 um，顶部），RNAish为40倍（比例尺=25 um，中心）和100倍比例尺=10 um，底部）。另请参见图S1。
图2
图2。N-Myc过度表达与侵袭性NEPC样前列腺癌相关
A类H&E染色（顶部）或AR IHC（底部）前列腺组织的显微照片显示，低倍镜（左侧，原始放大4倍，比例尺=5 mm）和高倍镜（右侧，原始放大40倍，比标尺=50 um）下，囊内癌病灶呈AR阳性（黑色矩形），嗜碱性病灶呈AR阴性（红色矩形）; 来自一个三个月大的孩子铅-克里+/-; Pten公司飞行/飞行; LSL-MYCN公司+/+.B。H&E染色（顶部）或AR IHC（底部）前列腺组织的显微照片，显示侵袭性、AR阳性腺癌病灶（黑色矩形）和AR阴性NEPC病灶（红色矩形），低倍镜（左侧，原始放大4倍，比例尺=5 mm），膀胱侵犯（黄色星号）高倍率（右，原始倍率40×，比例尺=50 um）；来自一个三个月大的孩子Pb-Cre公司+/-; 铂族飞行/飞行; LSL-MYCN公司+/+参见图S2 S3和表S1、S2、S3。
图3
图3。小鼠N-Myc签名与临床相关
A类Ward对来自两个独立队列的203个CRPC样本中779个优先基因的标准化FPKM值进行了分层聚类（IPM Cornell 2011-15，SU2C-PCF 2015）。所示p值来自CRPC-NE富集簇的超几何测试（红色）。Pearson相关性被用作样本的距离度量。注释跟踪报告病理分类（顶部）、综合NEPC评分（中部）和AR信号（底部）的值（较深的颜色表示得分较高）。每个病理分类的样本数量在相应图例的方形符号内报告。红线表示与其他样本相比，病理学和NEPC评分丰富的亚组（显示超几何平均p值）。小鼠N-Myc标记将人类样本分为两组，其中一组根据病理标准显著富集了CRPC-NE样本（p值<10-20（超几何检验），NEPC得分较高（p值～0，超几何检测）。B。将779个特征基因的表达水平投影到701个肿瘤样本RNA-seq数据的第一和第二主成分分析（PCA）中，包括498个神经母细胞瘤（NB）样本（Zhang等人，2015）。颜色表示肿瘤类别（CRPC、NEPC、NB，放大MYCN公司，带WT的NBMYCN公司).C类AR诱导基因和多个PRC2靶基因集的GSEA FDR q值的热图，与非N-Myc表达对应物相比，这些靶基因集在所示N-Myc基因型中识别的N-Myc下调基因中显著富集。D。右：标志性EMT基因集的GSEA富集图，显示了相应的统计指标；左图：卡弗小鼠基因集的GSEA富集图，代表去势后小鼠前列腺癌中下调的基因（卡弗等人，2011年）。参见图S3和表S2、S3。
图4
图4。LNCaP细胞中的N-Myc信号与临床相关，并显示AR信号的显著下调
A类左图：GSEA FDR q值的热图，如AR诱导基因和多个PRC2靶基因集（图3）所示，与非N-Myc表达的对应物相比，这些靶基因集在所示PTEN状态的表达N-Myc的人类前列腺癌细胞类型中识别的N-Myc去调节基因中显著富集。右图：显示最显著富集基因集的排名N-Myc特征中的Nelson对雄激素基因集的反应的GSEA富集图（Nelson et al.，2002）。B类雄激素（24小时，10 nM DHT）在所示细胞系中诱导AR靶基因表达的纳米线数据。C、。去势（虚线）或完整（实线）小鼠中22Rv1对照组（Cntl，左）或N-Myc（右）异种移植物（平均+/-标准误差平均值（SEM））生长速度的倍数变化。将每个时间点的每个肿瘤大小标准化为去势前1周获得的值（p值<0.0002，Student’s T检验）。天在具有或不具有24小时10nM DHT的木炭剥离血清中生长48小时后，在已知AR增强子下对指示基因的N-Myc进行ChIP PCR（插图：来自LNCaP-N-Myc细胞的N-Myc的Co-IP显示N-Myc与AR之间的相互作用，Aurora-A作为阳性对照）。另请参见图S4和表S3、S4、S5。
图5
图5。MPC类有机物培养模拟小鼠体内特征
A类MPC类器官的RT-QPCR和Western blot分析显示，在三苯氧胺诱导2周或不诱导2周的情况下，N-Myc mRNA和蛋白表达。B类H/E染色、细胞角蛋白5（CK5）和波形蛋白（Vim）IHC染色后，来自指定基因型小鼠的代表性小鼠前列腺类器官的显微照片（比例尺=50 um）。C类.QRT-PCR数据显示，在使用或不使用三苯氧胺的情况下，以及在使用10 nM DHT刺激1天后，来自有机物的指示AR靶基因的mRNA水平。所示为与经载体处理的类有机物培养物（n=3个独立的类有机化合物培养物）相比的平均和标准偏差倍变化。下图：T2-Cre+/+; 铂族飞行/飞行;LSL-MYCN公司+/+将含有或不含三苯氧胺有机物培养物的衍生前列腺有机物接种48小时，然后用苯扎鲁胺（1uM）处理72小时，并计算每个有机物的表面积。类有机物表面积分布的箱形图表示（每个条件下n>15个类有机物）。酶抑制剂减少了对照类有机物的表面积，但对N-Myc表达的类有机物没有显著影响。（p值=0.0021，学生T检验）。另请参见图S5和表S2、S3。
图6
图6。N-MYC增加细胞系和类器官中AKT信号
A类LNCaP-NMYC细胞中p-AKT的Western blot分析与LNCaP-cntl（上面板）的比较。单独或联合使用BKM120（1μM）和RAD001（100 nM）治疗24小时后，LNCaP-NMYC细胞中p-AKT和磷酸S6核糖体蛋白（Ser235/236）的Western blot分析与LNCaP-cntl进行比较（中间面板）。在存在或不存在MLN8237（100 nM）的情况下，使用为LNCaP-NMYC细胞和LNCaP-cntl获得的BEZ235指示剂量孵育72小时后的剂量反应（下面板）。B。前列腺类器官培养中的药物治疗。顶部：实验设计及以下：BKM120（1μM）和BEZ235（100 nM）处理48小时后p-AKT的Western blot分析。底部：BKM120对T2-Cre的剂量反应+/+; 铂族（f）/+;LSL-MYCN公司+/+类有机物培养与非诱导类有机物比较。另请参见图S6。
图7
图7。N-Myc与EZH2相互作用推动转录程序
A类H/E染色、EZH2和H3K27三甲基化（H3K27me3）IHC染色（比例尺=50 um）后，来自指定基因型的代表性小鼠前列腺的显微照片。B。在LNCaP-N-Myc细胞和LNCaP-N-Myc细胞中，用靶向EZH2 mRNA的siRNA敲除EZH2后，在EZH2或N-Myc下拉时，N-Myc、EZH2、SUZ12和AR的共免疫沉淀（上中），转染Myc标记的SET结构域缺失EZH2突变体（右上）或EZH2抑制剂GSK126或GSK343的6天处理（下）。如果低于70%，则以下值表示与车辆相比的交互百分比C、。顶部：根据靶向EZH2的siRNA处理的LNCaP-N-Myc细胞与对照siRNA或GSK343与载体处理的LNCaP-N-Myc细胞的比较，排名的基因中N-Myc下调基因集的GSEA富集图；底部：GSEA FDR q值的热图，如AR诱导基因和多个PRC2靶基因集（图3）所示，这些基因在N-Myc下调基因中显著富集，这些下调基因在siRNA-介导的EZH2敲除（48小时）或GSK343重复治疗（7天，5μM）后显著上调。D。左上角：维恩图显示LNCaP-N-Myc或对照（Cntl）细胞中启动子富集的H3K27me3 ChIP-seq读数之间的重叠；右上角：H3K27me3 ChIP-seq在所示细胞中读取，这些细胞定位于含有AR调节基因的染色体位点PMEPA1项目; 底部：已知EZH2结合位点的EZH2-ChIP-PCR，用于指示的EZH2靶基因或阴性对照基因(KIA0066号机组).E.公司。左：在指定剂量的EZH2抑制剂GSK126孵育6天后，LNCaP对照（Cntl）或LNCaP-N-Myc（N-Myc）细胞的细胞存活率百分比。F、。用150 mg/kg EZH2抑制剂GSK503（虚线）或载体（实线）治疗前、治疗期间（下面的橙色条）和治疗31或35天后（分别），单个22Rv1对照组（Cntl，左）或N-Myc（右）异种移植物生长速度的倍数变化。将每个时间点的每个肿瘤大小标准化为治疗第1天获得的值。另请参见图S7。
图8
图8。N-Myc/Aurora-A复合物可与变构Aurora-A抑制剂（例如MLN8237）结合
A类N-Myc/Aurora-A复合物的PLA。每个红点代表一个交互作用（比例尺=5 um）。下图：经载体或100 nM MLN8237处理48小时的LNaP-N-Myc细胞中PLA测定的代表性图像。B。以指定剂量或siRNA靶向使用指定Aurora-A抑制剂治疗后LNCaP-NMyc细胞中N-Myc的Western blot分析奥卡mRNA持续48小时。C、。Western blot显示了相同细胞的剂量反应数据。天增加Aurora-A抑制剂MLN8237剂量后的有机物培养活力测定。所示为与经载体处理的类有机物培养物（n=3个独立的类有机化合物培养物）相比的平均和标准偏差倍变化。E类.RT-QPCR的聚乙二醇10和波形蛋白(VIM公司)mRNA在MLN8237（1μM）治疗一个时间过程后。
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