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.2016年10月10日10:6:34904。
doi:10.1038/srep34904。

钙调节异常导致FTLD患者iPSC-derived神经元变性

Imamura惠子 1, Naruhiko撒哈拉 2, 尼古拉斯·M·卡南 三, Kayoko Tsukita株式会社 1, 近藤隆彦 1, 久藤由美子 4, 宇塔卡·奥萨瓦 4, 吉希德·苏纳达（Yoshihide Sunada） 4, 川上光一 5, 阿基苏·霍塔 1, 佐藤雅瓦塔 6, 渡边代 6, 长谷正人 7, 约翰·特罗亚诺夫斯基 8, 弗吉尼亚·M·Y·李 8, Tetsuya Suhara公司 2, Makoto Higuchi公司 2, 井上春久 1
附属公司

钙调节异常导致FTLD患者iPSC-derived神经元变性

今村惠子等。 科学代表. .

摘要

编码tau（一种微管相关蛋白）的基因MAPT突变会导致家族性神经退行性疾病的一种亚型，称为额颞叶退行性tau病（FTLD-tau），该病以痴呆为特征，以大脑额叶和颞叶萎缩为特征。虽然诱导多能干细胞（iPSC）技术有助于体外研究FTLD-Tau患者神经元细胞的表型，但FTLD-Tao患者神经元是如何退化的尚不清楚。在这里，我们通过Neurogenin2诱导FTLD-Tau患者iPSC的直接神经元分化，建立了FTLD-Tao的神经元模型。我们发现，无论是MAPT内含子突变还是外显子突变，FTLD-Tau神经元都会积累并在细胞外释放错误折叠的Tau，然后发生神经元死亡，我们用CRISPR/Cas9纠正内含子突变证实了这一点。FTLD Tau神经元表现出Ca增加的失调2+电刺激引起的瞬变。神经活性相关钙的化学生成或药物控制2+通过引入设计药物（DREADDs）专门激活的设计受体或通过谷氨酸受体阻滞剂治疗来减少错误折叠的τ累积和神经元死亡。这些数据表明，神经元活动可能调节τ蛋白病的神经变性。该FTLD-Tau模型为τ蛋白病的发病机制和潜在的治疗途径提供了机制性见解。

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数字

图1
图1。具有内含子或外显子的FTLD-Tau患者iPSCs的生成地图突变和基因编辑用于等基因控制。
(一)家族性FTLD-Tau患者产生的iPSCs地图突变显示ESCs样形态（相位图像），并表达多能干细胞标记物SSEA4和Nanog。比例尺=100μm。(b条)FTLD-Tau1 iPSC线路带有地图内含子突变（内含子10+14C→T），FTLD-Tau2 iPSC系携带地图外显子突变（R406W）。(c、 天)使用CRISPR/Cas9系统校正FTLD-Tau1中的突变（FTLD-Tau1校正）。桑格序列分析显示基因编辑后突变得到了纠正。(e（电子）)RT-PCR显示FTLD-Tau1神经元4重复tau表达增加，FTLD-Tua1校正神经元4重复和3重复tau正常表达率。凝胶的全长图片如图S4（a）所示。(（f）)细胞裂解物用lambda磷酸酶去磷酸化，并用SDS-PAGE分离，与重组tau梯形图进行比较，然后使用抗总tau抗体（Tau12）进行检测。FTLD-Tau1的带型改变在FTLD-Tau1校正后发生逆转。斑点的全长图片如图S4（b）所示。
图2
图2。FTLD-tau神经元中错误折叠tau的积累。
(一)FTLD-Tau建模的实验时间线。(b条)Western blot分析显示生成神经元中的总tau、MAP2A/B和βIII微管蛋白。神经细胞系间MAP2A/B水平无显著差异，表明神经细胞分化无显著差异。图S4（c–f）显示了吸墨纸的全长图片。(c（c）)用TOC1抗体（红色）以点状模式检测FTLD-tau神经元（绿色，βIII微管阳性细胞）中细胞内错误折叠的tau积累。比例尺=10μm。(d、 e（电子）)FTLD-Tau神经元的斑点杂交分析。FTLD-tau神经元细胞裂解液中错误折叠的tau/总tau比率增加（n=3；单因素方差分析，p<0.05；临时的试验，*p<0.05）。(（f）)在非还原条件下使用TOC1抗体进行的Western blot分析显示FTLD-tau神经元的细胞裂解物中的高分子tau折叠错误。图S4（g，h）显示了吸墨纸的全长图片。(g、 小时)FTLD-Tau神经元的斑点杂交分析。FTLD-tau神经元培养液中错折tau/总tau的比率增加（n=3；单因素方差分析，p<0.05；事后（post-hoc）试验，*p<0.05）。(我)利用TOC1抗体捕获和抗人tau抗体检测，通过ELISA对培养基上清液中错误折叠的tau进行定量。FTLD-tau神经元培养液中错误折叠的tau水平增加（n=3；单因素方差分析，p<0.05；事后（post-hoc）试验，*p<0.05）。
图3
图3。FTLD Tau神经元的钙失调和神经元损失。
(a、 b条)电刺激后的钙成像。细胞内钙2+电刺激升高的FTLD-Tau神经元的水平高于对照组（n=6；单因素方差分析，p<0.05；临时的试验，*p<0.05）。(c、 天)对照组和FTLD-Tau神经元第8天和第21天βIII微管蛋白和NeuN的免疫荧光染色。与对照神经元相比，FTLD-Tau神经元从第8天到第21天的存活率降低（n=6；单因素方差分析，p<0.05；事后（post-hoc）试验，*p<0.05）。
图4
图4。钙调节减轻神经退行性变2+大量涌入。
(一)设计药物（DREADD）系统特异激活的设计受体模式，用于调节神经元活动。(b条)用TOC1抗体对非还原条件下SDS-PAGE后FTLD-tau神经元错误折叠的tau进行Western blot分析。用CNO刺激M4D神经元可降低细胞裂解液中错误折叠的tau水平。印迹的全长图片如图S4（i，j）所示。(c、 天)FTLD-tau神经元培养液中错误折叠的τ（TOC1）和总τ（Tau12）的斑点杂交分析。用CNO刺激M4D神经元可降低细胞外错误折叠tau的水平（n=3；学生-吨试验，*p<0.05）。(e（电子）)AP-5或CNQX治疗可提高FTLD-Tau1神经元的存活率。（n=6；单因素方差分析，p<0.05；事后（post-hoc）试验，*p<0.05）。条形图表示平均值±SEM(（f）)AP-5或CNQX治疗可提高FTLD-Tau2神经元的存活率。（n=6；单因素方差分析，p<0.05；事后（post-hoc）试验，*p<0.05）。条形图表示平均值±SEM(克)我们的调查结果摘要。
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