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.2016年9月20日5:5:e14810。
doi:10.7554/eLife.14810。

自噬相关FYVE（Alfy/WDFY3）是哺乳动物大脑中建立神经元连接所必需的

乔安娜·M·德拉吉奇 1, 高崎久岛 2 三, 梅古米·平谢·伊凯达（Megumi Hirose-Ikeda） 1, 迈克尔·S·尹 1, Eveline Eenjes公司 1, 琼·博斯科 1, Leora M福克斯 1 4, 阿尔夫·H·利斯塔德 5, Tinmarla F Oo公司 1, 奥尔加·亚里吉纳 1, 三田友弘 6, 佐佐希·瓦古里 7, 一村吉野 6, 小松Masaaki 6, 安妮·西蒙森 5, 罗伯特·E·伯克 1 2 三, 卡罗尔·梅森 2 三 8 9, 山本爱 1 2 三
附属机构

自噬相关FYVE（Alfy/WDFY3）是哺乳动物大脑中建立神经元连接所必需的

乔安娜·M·德拉吉奇等。 埃利夫. .

摘要

蛋白质降解的调节对于维持适当的环境以协调复杂的细胞信号事件和促进细胞重塑至关重要。自噬相关FYVE蛋白（Alfy）以前被确定为泛素化货物和自噬机制之间的分子支架，在发育中的中枢神经系统中高度表达，表明该途径在神经发育中可能具有尚未探索的作用。为了检验这种可能性，我们使用小鼠遗传学来消除Alfy的表达。我们报告称，这种进化上保守的蛋白质是整个大脑和脊髓轴突束形成所必需的，包括主要前脑连合的形成。与反映轴突导向失败的表型一致，小鼠中Alfy的丢失破坏了胶质路标细胞的定位，并减弱了对Netrin-1的反应中轴突的生长。这些发现进一步支持了大量自噬在中枢神经系统发育中发挥关键作用的日益增长的迹象。

关键词：阿尔菲；自噬；Wdfy3；轴突导向；肿瘤生物学；胼胝体；小鼠；神经发育；神经科学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.Alfy在发育中和成年小鼠中枢神经系统中高度表达。
(A类)（上图）RT-PCR表明，早在胚胎第11天（E11）就可以检测到Alfy/Wdfy3，并在整个妊娠期（E19）保持丰富。(A类)Alfy基因5'区的多重PCR，Wdfy3公司具有III类β-微管蛋白（βIII，顶部）和胶质纤维酸性蛋白（Gfap，底部）。（Btm）转录水平相对于βIII（黑色）和Gfap公司（灰色），n=4，条形代表平均值±SEM(B类)现场P0小鼠切片杂交显示Wdfy3公司整个大脑。将低倍图像拼接在一起，以显示代表Wdfy3公司野生型小鼠的mRNA分布。在新生的CNS中观察到大量的mRNA（n=4），而在Alfy KO小鼠中未观察到背景以上的mRNA染色（数据未显示）。ISH反映了Alfy在大脑中的高表达方式（图1-图补充1），这种表达同时是神经元和胶质细胞（图1–图补充2）。缩写：小脑（cb）、大脑皮层（ctx）、海马（hp）、下丘脑（ht）、中脑（mb）、嗅球（ob）、纹状体（st）、上丘（sc）和丘脑（th）。(C类)免疫印迹显示Alfy在成人大脑中保持表达。成人大脑不同区域产生的裂解物，包括脑干（bs），用针对其N末端的Alfy抗体进行检测。γ-微管蛋白显示为负载控制（n=4）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.003
图1——图补充1。
图1补充图1。Alfy/Wdfy3在大脑中的表达最高。
(A类)半定量RT-PCRWdfy3公司成年小鼠不同器官中的mRNA。的相对水平Wdfy3公司跨不同器官的mRNA（校正为β-肌动蛋白）定量如下（n=5）。条形代表平均值±SEM。Wdfy3公司RNA在大脑中表达最高，尽管在所有被检查的组织中都能检测到转录物。(B类)成年小鼠组织样本中Alfy的免疫印迹。使用细胞骨架蛋白vinculin标准化相对蛋白水平，如下所示（n=6）。横条代表平均值±SEM。与之前的结果一致，Alfy蛋白在大脑中最丰富。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.004
图1—图补充2。
图1补充图2。Alfy在神经元和星形胶质细胞中表达。
(A类)在有或没有有丝分裂抑制剂的情况下，原代皮层培养物生长7天。在电镀后将有丝分裂抑制剂添加到培养物中，以防止神经胶质增殖并产生富含神经元的培养物。七天后，从培养物中制备裂解物，并用针对Alfy、胶质标记物GFAP和神经元特异性微管蛋白BIII的抗体检测含有5µg总蛋白的蛋白质印迹。正如预期的那样，有丝分裂抑制培养物的GFAP表达最低，但含有丰富的BIII微管蛋白。在有丝分裂抑制的培养物中检测到Alfy，暗示神经元内源性表达Alfy。实验重复两次，使用两窝小鼠（对照组n=3；KO n=3）。(B类)在传代并允许分化14天的星形胶质细胞原代培养物制备的裂解液中检测到Alfy。用抗Alfy和GFAP抗体检测含有3µg总蛋白的蛋白质印迹。显示了两种独立文化的结果。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.005
图2。
图2：两行基因敲除（KO）小鼠显示Alfy对出生后生存至关重要。
(A类,B类)Alfy GT小鼠。(A类)GT盒引入剪接受体位点（SA），并通过引入聚腺苷酸化（pA）尾部导致转录提前终止。的翻译起始站点Wdfy3公司位于第四外显子。RT-PCR表明基因陷阱插入导致Wdfy3公司转录本（图2-图补充1A，B）。(B类)用抗Alfy和βIII的COOH末端抗体检测脑裂解物的Western blot（n=5）。缩写：长末端重复序列（LTR）、新霉素（NEO）、磷酸甘油激酶-1启动子和Bruton酪氨酸激酶剪接供体位点（PGK-BTK-SD）。(C类,D类)Alfy KO小鼠。(C类)有条件（flox）Wdfy3公司等位基因是通过在外显子5侧面插入两个loxP位点（红色三角形）而产生的，导致暴露于Cre后其被切除，并产生较小的敲除（KO）“Δ”等位基因。注明了用于基因分型的两个正向引物和一个反向引物（箭头）（另请参见图2补充图1C）。(D类)免疫印迹法检测杂合子（Alfy Het，n=6）脑裂解物中的Alfy，但在Alfy KO小鼠（n=7）中未检测到Alfy。(E类——G公司)新生Alfy GT小鼠的特征。(E类)新生的Alfy GT和窝鼠控制（Ctrl）小鼠。箭头显示，对照幼崽的胃充满了牛奶，而它们的GT窝友则没有。(F类)Alfy GT幼崽始终小于对照组。基因分型后，将动物的体重按百分位排序并分为四组。大约50%的Alfy GT小鼠（8/15）的出生体重处于最低的第25百分位，而杂合子和野生型同窝小鼠占出生体重在第75百分位或更高的小鼠的92%（12/13）。数据收集自10窝小鼠，n=55。Alfy KO幼崽与其杂合子同窝幼崽之间也观察到类似的差异（数据未显示）。(G公司)Alfy GT幼犬缺乏翻正反射。每只幼崽执行任务所用的时间是三次试验的平均值，并记录为向右的延迟时间。Alfy GT未能在60秒内从背部旋转至腹部。单因素方差分析显示，基因型对幼犬行为有显著影响（n=6 WT，9 Alfy-GT-Het，7 Alfy TG；F（2,17）=20.90，p＜0.001）。Fisher的PLSD测试表明，Alfy GT和WT（p<0.001）或杂合子（p<0.00）同卵双胞胎之间存在显著差异。横线代表平均值±SEM。Alfy KO幼崽与其杂合子同窝幼崽之间观察到类似的差异（图2补充图1D）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.006
图2——图补充1。
图2-图补充1。Alfy GT和Alfy KO小鼠的创建和表征。
(A类,B类)创建Alfy GT小鼠。(A类)野生型（WT）、Alfy-GT杂合子（Alfy GT-Het）和Alfy-GT小鼠的PCR基因分型。(B类)Alfy GT小鼠的半定量RT-PCR。的5'和3'部分Wdfy3公司RT-PCR检测不到Alfy GT小鼠的mRNA转录。β-actin显示为对照。n=2 WT，3 Alfy GT Het，3 Alf GT）(C类)Alfy KO小鼠的PCR基因分型。基于PCR的纯合和杂合条件基因分型重量3等位基因(Wdfy3公司液氧磷/+和Wdfy3公司液氧磷/液氧磷,分别）和WT、Alfy KO杂合子（Alfy KO Het）和Alfy KO小鼠。(D类)小鼠天生具有从仰卧到俯卧的正确姿势。为了确定阿尔菲的消失是否会影响这一行为，将标记好并经过加热的幼崽放在平坦的表面上，让它们旋转60秒，以俯卧姿势。每只幼崽执行任务所用的时间是三次试验的平均值，并记录为向右的延迟时间。与Alfy GT小鼠相似，Alfy KO小鼠在60秒内无法从背部旋转到腹部（图2）。单因素方差分析显示，基因型对幼犬行为有显著影响（n=4/基因型；F(1, 6)=43.14，p<0.001）。条形代表平均值±SEM。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.007
图3。
图3：社区未能适当跨越中线阿尔菲GT和KO大脑。
(A类,B类)新生（P0）对照组或阿尔菲突变（Alfy GT或Alfy KO）小鼠的前脑Nissl染色。图中显示了冠状截面。Alfy突变体具有许多异常特征，包括心室扩大（*）和明显的白质异常，包括中线处胼胝体（cc）缺失（黑色箭头）、前连合不可检测（ac，白色箭头）和内囊畸形（矩形）。更多的尾侧切片可以在图3补充图1A中找到。n=6 WT，3 Alfy GT Het，7 Alfy燃气轮机；n=3 Alfy Het，3 Alfy KO。(C类,D类)免疫染色显示Alfy突变小鼠的轴突异常。图中显示了冠状截面。阿尔菲突变体大脑中的三个主要前脑连合点未能穿过中线。(C类)cc、海马连合（hc）和(D类)阿尔菲突变体中没有ac表示中线和缺乏轴突连接。方框区域在下面放大显示。n=5/基因型。缰和后连合可在图3补充图2中找到。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.009
图3——图补充1。
图3补充图1。阿尔菲突变小鼠的轴突投射异常且紊乱。
(A类)新生儿脑H&E染色显示Alfy GT小鼠的脑形态发生改变。图中显示了冠状截面。如果没有阿尔菲，大脑皮层（ctx）、丘脑（th）和海马（hp）就会畸形。阿尔菲阴性小鼠的其他异常包括丘脑缩小。Alfy杂合子与WT同窝卵无法区分（数据未显示）。野生型老鼠显示为对照（Ctrl）。n=3/基因型。比例尺=250μm。(B类)NF染色显示Alfy突变脑的异常和无组织轴突投射。图中显示了冠状截面。Alfy GT小鼠的ctx染色减少，内囊（ic）和hp内束的NF染色异常。Ctrl中明显可见反屈束（fr，方形框）、哺乳动物丘脑束（mt，圆形）和大脑脚（箭头），但Alfy GT（虚线框）中表现为异常、紊乱的轴突束。外部胶囊（箭头）存在于Ctrl和Alfy空大脑中。n=5/基因型。其他缩写：下丘脑（ht）、中脑导水管周围灰质（pag）、纹状体（st）和上丘（sc）。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.010
图3——图补充2。
图3补充图2。缰和后连合轴突的异常和无组织投射。
(A类)顶部面板显示了Ctrl和Alfy GT冠状截面的低倍放大。箭头指向缰连合（hac），下面放大显示。(B类)后连合（pc）。在Alfy GT小鼠中，两者都出现了形态异常，尽管都越过了中线。n=3/基因型。比例尺如图所示。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.011
图4。
图4：中线交叉缺陷延伸至Alfy GT和KO大脑中的视交叉，可能是由于路标胶质细胞的定位受到干扰。
(A–C)在Alfy突变小鼠中观察到视网膜交叉缺陷。(A类)所有P0视交叉在视盘处单侧标记DiI。白色虚线框中表示的同侧投影，如下所示。WT和GT杂合同卵双胞胎无法区分。杂合小鼠显示为对照（Ctrl）。(B类)同侧指数的计算示意图。在500 x 500µm范围内测量对侧和同侧视束的像素强度2. (C类)Alfy突变小鼠的同侧指数大于WT和杂合（GT-Het）同卵对照，表明同侧投射异常增大。条形图代表平均值±SEM，统计分析采用单向方差分析，然后采用Tukey’s事后（post-hoc）测试。每个基因型的相应n值在条形图中注明*p<0.05。(D类,E类)P0前脑GFAP免疫染色显示路标胶质细胞定位错误。图中显示了冠状截面。(D类)胶质细胞的胶质楔（gw）、灰质毛被（ig）和中线拉链（mz）胶质细胞群位于WT窝鼠脑中的预期位置（Ctrl）。在Alfy GT大脑中，ig无法检测到（预期位置用“*”表示），gw和mz细胞紊乱。n=3/基因型。(E类)这两种基因型海马伞（fi）和齿状回（dg）内的胶质细胞数量都很明显。方框区域在下面以较高的放大倍数显示。n=3/基因型。图4补充图1和图2显示了可能有助于前脑轴突连接的其他潜在内在改变。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.012
图4——图补充1。
图4-图补充1.Alfy的缺失会导致新皮层增殖的适度变化，但不会导致细胞死亡。
(A类)Alfy的缺失导致皮质板厚度中度但显著降低。P0皮层的测量结果表明，Alfy GT大脑（n=3）的皮层板/亚板（CP/SP）适度但显著薄于对照（Ctrl，n=3，t（4）=5.30，p<0.01）。边缘区（MZ）和中间区（IZ）没有达到显著性，（t（4）=1.67，p=0.17和t（4”=2.38，p=0.076）。横线表示平均值±St.Dev；*，p<0.01。(B类,C类)Alfy缺失导致E15.5处细胞增殖出现细微缺陷，但E13.5处细胞增殖没有明显缺陷。在E13.5或E15.5的时间妊娠母鼠中一次性注射BrdU，并收集胚胎1 注射后hr。(B类)在所有三个同窝基因型（WT:n=2，杂合：n=3，Alfy GT n=3；两窝）的脑室下区和深层皮质层中均检测到一条清晰的BrdU阳性细胞带（红色）。Hoechst 33342核DNA染色为蓝色。(C类)使用比色法BrdU量化发育中皮质板中增殖细胞的数量。在E13.5，定量显示Alfy KO和杂合子同窝对照（Ctrl）t（8）=1.59，p=0.15（Ctrl:n=5，Alfy GO:n=5,2窝）之间的BrdU阳性（BrdU+）细胞数量没有显著差异。在E15.5，没有Alfy时出现了适度但显著的下降，t（8）=3.12，p<0.01（Ctrl:n=4，Alfy KO:n=6；两窝）。条形表示平均值±SEM.ns，不显著；*，p<0.01。(D类)Ki67阳性表明新生Alfy GT小鼠的增殖正常。方框区域突出显示心室下区（VZ），在下面的图像中以更高的放大倍数显示。进行体视学以量化亚VZ中Ki67阳性细胞的数量（Gundersen Coefficient of Error=0.15，Ctrl（野生型同窝出生，n=3）=187221个细胞，S.D.=19634，而Alfy GT（n=3）=179074个细胞，S.D.=28917，t（4）=0.40，p=0.71。）(E类)针对裂解caspase-3的免疫组织化学（棕色）显示，在没有Alfy的情况下，胚胎期E15.5的细胞死亡没有显著差异。图像插图的放大图像如下所示。这个年龄段的大脑皮层没有检测到细胞丢失。作为阳性对照，包括该年龄段三叉神经节中观察到的自然发生的细胞死亡（最左侧的面板）。在基因型之间没有观察到差异（n=2 WT，2 Alfy GT-Het；3 Alfy-GT）。组织切片用Nissl复染，显示为紫色。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.013
图4——图补充2。
图4补充图2。在Alfy GT大脑中观察到局灶性皮质发育不良。
(A类)E15.5 Alfy GT大脑（n=3）中的双皮质蛋白（DCX，绿色）染色与同窝对照组（Ctrl，n=3。(B类)与同窝对照组（Ctrl）相比，在Alfy GT小鼠中观察到深层Tbr1阳性皮质投射神经元的规格。每个基因型的三只小鼠被染色为Tbr1（顶部，红色），并用Hoeschst 33342（底部，蓝色）进行复染，所有小鼠都显示出这种模式。(C–E类)Alfy空脑中的局灶性皮质发育不良（FCD）。H&E染色显示冠状面存在FCD(C类)和矢状的(D类)Alfy GT大脑的部分。方框区域以更高的放大率显示在下面。FCD标有箭头。(E类)早在E15，Alfy GT小鼠（6/6）就可以通过Nissl染色检测到FCD，但在对照胚胎（0/6）中无法检测到。箭头指向位于Alfy GT胚胎同一半球内的多个FCD。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.014
图5。
图5阿尔菲突变体大脑和脊髓中轴突束发育异常。
(A类,B类)间脑冠状切面(A类)E15.5（n=3/基因型）和(B类)E17.5（n=3/基因型）染色为神经丝（NF，红色），核染色为Hoechst 33342（蓝色）。发育中的内囊用黄色方框（顶部）和高倍镜突出显示，NF染色的共焦图像显示为（中部）和（底部）Hoechst 33342。在对照组大脑（Ctrl）中，组成内囊的轴突在神经节隆起内形成由捆绑轴突组成的扇形投射物。Alfy GT中发现的异常的、腹侧移位的、节状轴突束用白色箭头标记。神经细胞粘附分子L1（NCAML1）染色显示类似缺陷（图5-图补充1）。(C类,D类)TH染色显示D能细胞群的异常投射。(C类)冠状切面。Alfy GT大脑中存在A9和A10 D能量群体，看起来不成熟（上图）。下丘脑A13 DA能细胞群和中前脑束（mfb）存在于Alfy GT脑的间脑中；然而，观察到下丘脑异常投射和异常中线交叉事件（箭头，底部）。n=3/基因型。(D类)用Nissl复染矢状断面。在Alfy GT大脑中，mfb向下丘脑有异位腹侧投射（箭头，底部）。方框区域在下面以较高的放大倍数显示。n=3/基因型。(E类)E13.5颈髓NF染色。图中显示了冠状截面。脊髓背侧的高倍图像如下所示。Alfy GT胚胎中观察到的异常NF模式用白色箭头突出显示。n=3/基因型。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.015
图5——图补充1。
图5补充图1。NCAML1染色证实Alfy GT发育中内囊的轴突缺陷。
用Hoechst 33342（蓝色）（顶部）对E15.5大脑中NCAML1（红色）的免疫荧光进行复染。方框区域以较高的放大倍数显示，带有和不带复染色（底部）。箭头表示Alfy GT大脑中的投影形成异常束状结构。n=4个窝友控制，4个Alfy GT。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.016
图6。
图6 Alfy定位于轴突并富集于膜部分。
(A类)免疫荧光图像显示MAP2阳性神经元表达Alfy。合并的彩色图像显示mCherry-Alfy在MAP2阳性神经元中的共同定位。Alfy位于胞体内，与MAP2阳性投射共存。在三种独立的培养基中重复三次转染。βIII Tubulin投影的彩色化如图6补充图1所示。(B类,C类)成人皮质裂解物的分离表明，Alfy富集为膜组分。(B类)通过免疫印迹法分析每个组分等量的蛋白质。Alfy存在于富含LC3-II和突触素（P3，LP1；盒）的膜组分中(C类)相对于总匀浆分数（H）测量的折叠富集度。条形代表平均富集度（n=3）±SEM。分馏的示意图见图6补充图2。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.017
图6——图补充1。
图6补充图1。Alfy在神经元的胞体和轴突中表达。
(A类,B类)用含有全长或截短标记的Alfy cDNA的质粒转染Alfy对照混合原代皮层培养物。(A类)典型的共焦图像显示了使用针对荧光标记和共染色MAP2或BIII微管蛋白的抗体检测到的Alfy标记结构。在MAP2-和BIII小管阳性投射物中检测到Alfy全长和C末端片段（箭头所示）。(B类)典型的共焦图像显示了使用针对荧光标记（左）的抗体检测到的Alfy标记结构，并与GFAP共同染色。Alfy在星形胶质细胞中表达，尽管大的小泡和细胞核没有染色。研究在三种独立的文化中重复进行。(C类,D类)确定Alfy、Alfy KO或Ctrl的亚细胞分布(A类,B类)用含有全长tagged-Alfy的质粒转染混合原代皮层培养物。为了证实转染，并行转染COS-7细胞并进行免疫印迹。文丘林显示为加载控件。(C类)全长Alfy标记蛋白以预期大小迁移，并用抗mCherry和抗Alfy抗体检测。过度曝光的图像对于显示内源性Alfy是必要的，因为它在非神经元细胞中的丰度要低得多（圆形）。(D类)Alfy的全长和截断构造。研究在三种文化中重复进行。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.018
图6——图补充2。
图6-图补充2.Alfy富含来自大脑的膜部分。
图6A中使用的改良突触体制剂的示意图，基于之前发布的协议（Hallett等人，2008）。缩写：H，匀浆；P1，核和大碎片；S1，可溶性细胞质；P2，粗制突触体膜；S2，可溶性细胞质；P3，光膜；S3，可溶性细胞质；LP1，富含突触体膜；LS1、突触小泡和突触蛋白。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.019
图7。
图7：轴突对Netrin-1的反应能力需要Alfy。
(A类,B类)不同基因型的初级皮层神经元形态相似。(A类)通过共焦显微镜对单个转染GFP的神经元进行成像，并在ImageJ中进行追踪。显示了两个杂合子（Het，n=5个大脑）和两个Alfy-KO神经元（n=5个大脑）的代表性最大投影图像。神经细胞骨架标记在不同基因型之间的表达具有可比性（图7补充图1A、B）。(B类)如A所示，对DIV7神经元的Scholl分析显示，基因型对交叉次数没有影响（n=50个神经元/基因型；F(1,97)=0.66，p=0.41）。分支分析（图7补充图1C）同样表明基因型没有影响。(C类,D类)Alfy KO皮层外植体对Netrin-1的反应性减弱。(C类)Alfy Het或Alfy KO皮质外植体在对照（Ctrl）或Netrin-1存在下的代表性图像，如所述（图7-图补充2），并用βIII Tubulin染色。(D类)72岁后外生长平均长度的量化 根据从两胎小鼠54个外植体（Alfy Het用Ctrl处理：n=15；Alfy Heat用Netrin-1处理：n:12；Alfy-KO用Ctrl=12，Alfy KO用Netrin-1:n=15）收集的数据进行培养。双向方差分析显示基因型（F(1,50)=7.69，p<0.01）和Netrin-1的存在（F(1,50)=7.71，p<0.01），以及基因型和Netrin-1暴露之间的显著交互作用（F(1,50)=12.29，p<0.001）。费希尔PLSD事后（post-hoc）分析表明，暴露于Netrin-1导致Alfy Hets的外生长显著增加（p<0.001），但Alfy KO的外生长没有增加（p=0.56）。在对照条件下，基因型之间的生长量没有差异（p=0.56）。Netrin-1吸引性引导也通过确定引导比来评估，该引导比是通过测量外植体最靠近表达线索的细胞块（近端）一侧的生长量与外植体最远离细胞块（远端）一侧的生长量来实现的。在我们的实验条件下，在对照外植体（t（25）=1.98，p=0.059）或KO外植体中（t（22）=1.77，p=0.091）未观察到对Netrin-1的定向生长反应，这表明在我们的试验条件下，HEK293T细胞分泌Netrin-1高于选择性促进吸引引导的阈值。48年后取得了类似的结果 培养基中的hr。条形代表平均值±SEM.*，p<0.001；ns，不显著。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.020
图7——图补充1。
图7补充1。不同基因型的初级皮层神经元相似。
(A类,B类)Alfy的丢失不会影响培养中分离神经元的生长和分化。Ctrl和Alfy KO小鼠体外第7天（DIV7）神经元表达细胞骨架标记(A类)Tau-1（红色）或(B类)MAP2（红色）和βIII Tubulin（βIII，绿色）阳性过程。合并的图像显示在顶部面板中，而每个荧光灯的各个通道显示在下面的灰度图像中。由Alfy Het或Alfy KO大脑生成的三种独立文化中的代表性图像。(C类)Alfy的丢失对分离的皮层神经元的突起生长没有影响。单因素方差分析显示基因型之间没有显著差异（F(1,97) =0.19，p=0.66）。数据表示为平均值±St.Dev.皮层培养物由五个独立培养物制备而成，共有10个神经元/培养物/基因型成像，分析了50个Alfy Het和50个Alf y KO神经元。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.021
图7——图补充2。
图7补充图2。Alfy KO轴突对引导信号的反应减弱。
(A类,B类)如图7C、D所示，进行皮层外植体培养，以检查对Netrin-1的反应中轴突的生长(A类)E14.5胚胎的大脑皮层发育图以红色突出显示。皮层外植体与嵌入琼脂糖的HEK293T细胞共同培养，这些细胞模拟转染（对照）或转染Netrin-1-Myc（Netrin-1）。瞬时转染的HEK293T细胞将Netrin-1-MYC强烈分泌到培养基中，如MYC标记的免疫印迹所示。对细胞骨架蛋白Vinculin的探索表明，培养基部分主要是无细胞的。(B类)低倍图像，缝合在一起以显示72天后的全部生长量 培养小时，取自皮质外植体，在对照细胞或表达Netrin-1的HEK293T细胞的存在下用βIII Tubulin（红色）染色（HEK293细胞的位置用白色箭头表示）。(C类)Alfy的丢失不会影响端脑中的引导线索受体水平。用针对Alfy，Robo1，DCC的抗体在Western blot上检测E14.5端脑裂解物。Alfy KO端脑中DCC和Robo1的数量与Alfy对照样品中检测到的受体丰度相等（DCC:t（5）=0.45，p=0.67；机器人1：t（4）=0.13，p=0.90）-内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.022
图8。
图8 Alfy是一种选择性大自噬的衔接蛋白(A类——D类)在没有Alfy的情况下，非选择性宏自噬正常进行。
(A类)围产期Alfy GT幼崽的肝裂解物显示LC3向LC3-II的转化更大，反映了由于它们无法正常进食而引起的饥饿反应（图2E）。正常喂养的WT和杂合子同窝小鼠的裂解液主要含有LC3-I。底部图表将LC3转化量化为LC3-II/LC3-I的比率。条形图表示平均值±St.Dev。方差分析显示基因型对LC3转化的显著影响（n=7 WT，6 Alfy GT-Het，6 Alfy GT；F(2,16)= 11.07; p<0.001）。费希尔PLSD事后（post-hoc）分析表明，Alfy GT小鼠的LC3转化与具有至少一个Alfy拷贝的小鼠显著不同。(B类)在Alfy GT小鼠的大脑中，LC3-II没有异常积累，表明自噬体成熟过程正常。单因素方差分析显示三种基因型之间没有显著差异（n=5/基因型；F(2,12)= 5.52; p=0.90）。(C类)在没有Alfy的情况下，饥饿引起的大自噬蛋白降解是正常的。长寿命蛋白质降解试验。（LC3点状构造如图8-图补充1A所示）。双因素方差分析显示治疗的主要影响显著（n=4/基因型；F(2,27)=24.93，p<0.001），但基因型对蛋白质水解百分比（%）没有显著影响（n=4/基因型；F(2,27)=1.82，p=0.18）。Fisher-PLSD事后分析显示，与完全培养基相比，饥饿期间所有基因型的蛋白质水解率均显著增加（p<0.001），添加5 mM 3MA显著减弱了饥饿诱导的蛋白质水解（p<0.00）。(D类)在没有Alfy的情况下，LC3在初级神经元中的转换是正常的，以响应营养因子的撤回（n=4/基因型）。为了积累LC3-II，细胞在20µM leupeptin的存在下饥饿。(E类)Alfy的损失阻碍了其货物ALIS的选择性宏观自噬周转。尽管当所有形式的宏自噬受阻时，很容易发现泛素化结构（图8，图补充1B），但只有特定货物的周转受到Alfy损失的影响。72天后原发性Alfy GT与Alfy杂合（HET）MEF的比较 小时Veh或5μM AraC。FK2免疫荧光（绿色）显示，泛素阳性ALIS小体是在有丝分裂抑制的反应下形成的。在没有阿尔菲的情况下，这些结构积累得更快（白色箭头）。n=3。对于易于聚集的扩展polyQ蛋白，也可以观察到类似的Alfy依赖性（图8补充图1C、D）。对于所有图表，条形图表示平均值±SEM.ns，不显著；*，p＜0.05。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.023
图8——图补充1。
图8补充图1。Alfy是选择性宏自噬的适配器。
(A类)在存在完整培养基的情况下，LC3免疫反应性（绿色）在细胞质中产生弥漫染色模式。当MEF培养物在HBSS中培养缺乏时，无论基因型如何，LC3反应都局限于不同的点，这表明LC3阳性自噬体的形成（n=4）。(B类)在没有应激的情况下，大自噬的抑制导致ALIS体的积聚。不朽的附件5KO MEFs（Kuma等人，2004）证明了FK2抗体（绿色）（n=3）显示的基础条件下泛素阳性聚集物（白色箭头）的积累。(C类,D类)在没有Alfy的情况下，选择性大分子自噬货物（扩大的聚谷氨酰胺包合物）积累得更快。在Ctrl和Alfy GT MEF中瞬时转染17aahtt103Q-eGFP。随着时间的推移，聚合被量化为(D类). Alfy GT MEF中含有聚集物的转染细胞百分比高于Ctrl。重复测量方差分析显示，基因型与聚集基因型的转染细胞百分比存在显著差异（n=3/基因型；F(1,8)=154.643，p=0.002），以及时间和基因型之间的显著相互作用（n=3/基因型；F(2,8)=55.332，p<0.0001）。事后分析（Fisher PLSD）显示，在Ctrl-MEFs中，“转染agg的细胞百分比”在24到48之间没有变化 小时（p=0.4144），但72小时后下降 小时（p=0.005）。相反，在Alfy GT MEF中，“转染agg的细胞百分比”随着时间的推移不断增加（24和48之间的比较 小时，p=0.0047；48与72的比较 小时，p=0.0105）。比例尺=25μm。数据表示平均值±标准偏差。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.14810.024
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