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.2016年10月10日；26(19):2635-2641.
doi:10.1016/j.cub.2016.07.039。 Epub 2016年9月8日。

CHMP7结合膜与ESCRT-III相关的核膜改造

尤兰达·奥尔莫斯 1, 安娜·佩德里克斯·罗塞尔 1, 杰里米·卡尔顿 2
附属公司

CHMP7结合膜与ESCRT-III相关的核膜改造

尤兰达·奥尔莫斯等。 当前生物. .

摘要

除了在胞质分裂、病毒出芽、内胚体分选和质膜修复过程中的细胞膜脱落中发挥作用外[1]，最近研究表明，运输-III（ESCRT-III）机械所需的内胚体分拣复合体在有丝分裂退出过程中密封了重整核膜（NE）中的孔[2,3]。ESCRT-III也在迁移诱导破裂时的间期修复NE[4,5]，突出了其作为该细胞器膜完整性协调器的关键作用。虽然ESCRT-III的NE定位依赖于ESCRT-IIII组分CHMP7[3]，但尚不清楚该复合物如何与核膜结合。这里我们证明CHMP7的N末端作为一种新型膜结合模块发挥作用。这种膜结合能力允许CHMP7与ER结合，ER是一种与NE连续的细胞器，它提供了一个平台，在有丝分裂退出期间指导NE募集ESCRT-III。CHMP7的N末端包含串联Winged-Helix结构域[6]，通过同源建模和结构-功能分析，我们确定了破坏膜结合并阻止CHMP7 ER定位及其随后在重整NE富集的点突变。这些突变还阻止下游ESCRT-III组分在重整NE处的组装，以及有丝分裂后核质间隔的正确建立。这些数据确定了ESCRT-III亚单位内的一种新的膜结合活性，该活性对有丝分裂后核再生至关重要。

关键词：ESCRT-III；细胞生物学；细胞分裂；有丝分裂；核膜。

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数字

图片1
图形摘要
图1
图1
CHMP7是一种ER-定位蛋白，在有丝分裂退出期间在NE富集（A）图示本研究中使用的结构。（B和C）经编辑表达mNG-CHMP7的CAL-51细胞通过抗CHMP7和抗Vinculin（B）或成像活细胞（C）的western blotting进行解析和检测。在本图和所有其他图中，内源性CHMP7用箭头标记(∗，非特异性带）。稳定表达GFP-CHMP7和GFP-CHMP 7的（D–F）HeLa细胞NT公司用抗-GFP、抗-CHMP7或抗GAPDH抗血清（E）或用抗Calnexin和DAPI固定和染色（F）进行蛋白质印迹检查。（D）中的图像代表了所有成像的细胞以及22/22（GFP-CHMP7）和21/21（GFP-CHMP7）NT公司)捕获的电影。GFP-CHMP7和GFP-CHMP7的共定标NT公司在7/7和13/13计分细胞中分别观察到Calnexin。（G） Cos7细胞的核后上清液通过连续碘xanol梯度进行分离，并用所示抗血清进行免疫印迹分析。（H） 对稳定表达GFP-CHMP7δNT的HeLa细胞进行活体成像。图像代表了所有拍摄的细胞和5/5拍摄的电影。时间间隔以皮质侵入后的秒数表示。在所有显微照片中，比例尺代表10μm。另请参见图S1。
图2
图2
CHMP7中的绘图活动NT公司Govern-ER定位（A）HeLa细胞转染了所示的GFP-CHMP7NT公司质粒和成像活；当先前在四个区块中突变时，β2-β3插入区内干扰内质网定位的单个残基（图S3B-S3D）突变为丙氨酸。网状定位如下：−，无/细胞质；+，减少；++，正常；和+++，增强）。在三个独立实验的指定数量的捕获图像中观察到网状定位。北卡罗来纳州，11/11；δ107–148, 0/11; δ 118–128, 0/13; S108A，12/12；D109A，11/11；W118A，0/13；I119A，11/11；S120A，11/11；W121A，0/12；F126A，0/12；L127A，0/14；L128A，0/14；K129A，13/13；P130A，13/13；L131A，0/12；K132A，2013年12月；W133A，13/14；M138A，15/15；L139A，11/12；G140A，16/16；D141A，13/13。（B） CHMP7中β2和β3之间插入的序列比对NT公司来自指定生物体的WH1域。保护范围如下：∗，完成；：，非常相似，弱相似；§，ER定位所需的残留物。（C） 对表达所指示的GFP-CHMP7构建体的HeLa细胞进行活体成像（皮层侵入后的时间以秒为单位）。图像代表了三分之三的采集电影和每一个突变中50/50个得分细胞。GFP-CHMP7 W118A在末期NE（盒装）上观察到有限的富集，这表明在这种情况下，ER定位仍存在一定程度。在所有显微照片中，比例尺代表10μm。另请参见图S2和S3。
图3
图3
CHMP7公司NT公司结合脂质膜GST或GST-CHMP7NT公司用Folch（A、B、E和F）或合成（C和D；60%1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱[DOPC]、20%1,2-二油酰基-sn甘油-3-磷丝氨酸[DOPS]和20%1,2-二油酰基-sn-甘油3--磷酸乙醇胺[DOPE]）脂质体培养5分钟（A和B）或15分钟（C–F）。在（A）中，添加更多量的脂质体（0、10或50μg）。In（D），2.5%1-2-二油酰基-锡-甘油（DAG）或1,2-二油酰-锡-如图所示，添加了3-磷酸甘油（PA）。通过超速离心收集脂质体。粒化（P）和可溶性（S）组分用抗GST抗血清进行蛋白质印迹分析。通过密度测定法对来自（A）、（C）和（E）的蛋白质印迹进行定量（平均值±SD）（B和D，N=3；F，WT，N=7；δ118-128，N=7,W121A，N=7:NS；L127A，N=4；L131A，N=0.4）。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验计算统计显著性(∗p<0.0001）。另请参见图S4。
图4
图4
CHMP7的膜结合对有丝分裂退出过程中ESCRT III依赖性NE重组至关重要（A）siRNA转染的HeLa细胞稳定表达GFP-CHMP4B和指示的HA-CHMP7R（右）蛋白质被实时成像（时间间隔以秒为单位）。（B） 从（A）定量GFP-CHMP4B的NE富集（平均值±SD；CHMP7 siRNA+HA-CHMP7R（右），23/23，N=4；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）δ118-128，0/15，N=3；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）L127A，1/16，N=3）。（C） 用抗CHMP7、抗HA或抗Vinculin的蛋白印迹法检测（A）细胞的裂解产物。固定（D和E）siRNA转染的HeLa细胞；抗微管蛋白、抗CHMP2A和DAPI染色；用免疫荧光（E）检测，或用抗CHMP7或抗GAPDH（D）蛋白印迹法检测。定量CHMP2A在末期NE的组装（D，平均值±SD；n=40，n=2；p=0.0008，通过双尾Student t检验计算）。（F和G）siRNA-转染HeLa细胞，稳定表达GFP-NLS和H2B-mCh，用抗CHMP7和抗HSP90（F）进行western blotting分析或实时成像，并计算所示时间点（G，Mean±SEM；对照，N=4，N=40；CHMP7 siRNA-1，N=3，p=0.010，N=28；CHMP7 siRNA-2，N=3，N=28，p=0.003）。在90分钟后使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验计算显著性。用对照或CHMP7-靶向siRNA转染稳定表达所示HA-标记的siRNA-resistance CHMP7蛋白的（H和I）HeLa细胞并固定；抗微管蛋白、抗CHMP2A和DAPI染色；用免疫荧光（H）检测，或用抗CHMP7、抗HA和抗GAPDH（I）蛋白印迹法进行解析和分析。对来自（H）的细胞进行定量（I，平均值±SD；对照，N=5，N=80；CHMP7 siRNA，N=4，N=34，p<0.001；CHMP7-siRNA和HA-CHMP7R（右），N=4，N=52，不显著[NS，p=0.995]；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）δNT，N=4，N=40，p<0.001；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）δ118-128，N=3，N=30，p<0.001；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）L127A，N=3，N=32，p<0.001；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R-NT公司/CHMP4B，N=3，N=31，NS[p=0.055]）。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验计算显著性(∗，显著）。（J） 稳定表达HA-CHMP7的HeLa细胞R（右）δNT转染对照或CHMP7-靶向siRNA；固定的；抗微管蛋白、抗CHMP2A和DAPI染色；免疫荧光检测。30例患者（Ctrl）和29例患者（CHMP7 siRNA）观察到CHMP2A的中体定位（N=3）。（K） 稳定表达GFP-NLS、H2B-mCh和所示HA标记的siRNA抗性CHMP7蛋白的siRNA转染的HeLa细胞通过用抗CHMP7、抗HA或抗GAPDH的蛋白质印迹进行检测，或进行活体成像，并在后期开始后90分钟计算核质区室化程度（平均值±SEM；对照组，1.93±0.04，N=9，N=236；CHMP7 siRNA，1.51±0.03，N=9，N=252，p<0.0001；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右），1.88±0.05，N=8，N=257，NS[p=0.8909]；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）δNT，1.54±0.08，N=4，N=207，p=<0.0001；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）δ118-128，1.53±0.1，N=3，N=101，p=0.0003；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R（右）L127A，1.50±0.08，N=3，N=101，p=0.0001；CHMP7 siRNA和HA-CHMP7R-NT公司/CHMP4B，1.73±0.1，N=3，N=76，NS[p=0.1556]）。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验从实验平均值（N）计算统计显著性；∗，意义重大。显示Tukey胡须和平均值（+）。在所有显微照片中，比例尺代表10μm。
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参考文献

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