跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并且被安全地传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年11月1日；27(21):3293-3304.
doi:10.1091/mbc。E15-10-0730。 Epub 2016年8月31日。

急性游离胆固醇积累诱导体外培养人肝细胞内质网和脂滴的紫苏素2和Rab18依赖性融合的降解

Asami Makino公司 1 2 三, 弗朗索瓦斯·胡林·马苏达 1 2 三, Motohide Murate公司 三, 安倍晋弘 三, 纳里奥·托米希奇 三, 福田光彦（Mitsunori Fukuda） 4, 山下静亚 5, 藤本丰史 6, 休伯特·维达尔 1 2, 米歇尔·拉加德 1 2, 伊莎贝尔·德尔顿 1 2, 小林俊彦 7 2 三 8
附属公司

急性游离胆固醇积累诱导体外培养人肝细胞内质网和脂滴的紫苏素2和Rab18依赖性融合的降解

Asami Makino公司等。 分子生物学细胞. .

摘要

肝胆固醇动态平衡失调和肝内游离胆固醇积聚与非酒精性脂肪性肝炎的发病机制有关，导致肝毒性的慢性化。在这里，我们研究了游离胆固醇积累对培养肝细胞中脂滴（LDs）的形态和生化特性的影响。急性游离胆固醇积聚导致LDs融合，随后LDs外壳蛋白、紫苏素2（PLIN2；也称为亲脂蛋白或脂肪分化相关蛋白）降解，以及载脂蛋白B100（ApoB100）与LDs的结合。PLIN2的降解被泛素化、自噬和蛋白质合成抑制剂抑制。结果表明，ApoB 100与LDs的关联依赖于低分子量GTP结合蛋白Rab18的活性，并突出了LDs作为肝细胞游离胆固醇毒性靶点的作用。

PubMed免责声明

数字

图1：
图1：
用ACAT抑制剂处理Huh7细胞可增加LD。（A） Huh7细胞在没有（对照）或存在10μg/ml F1394或10μg/ml58-035的情况下培养24小时。然后用2μg/ml BODIPY 493/503标记细胞30分钟。Bar，10μm。（B） 用LPDS（Chol）中的MβCD/胆固醇或LPDS中的M？CD/胆固醇加58-035（Chol+58-035）处理细胞，如材料和方法用BODIPY 493/503标记细胞。棒材，10μm。（C） LD的大小分布如中所述进行了量化材料和方法用10μg/ml F1394或10μg/ml58-035处理Huh7细胞24小时后。（D） 在用LPDS中的MβCD/胆固醇（Chol）或LPDS中的MβCD/胆固醇加58-035（Chol+58-035）处理Huh7细胞24小时后，定量LD的大小分布。
图2：
图2：
用F1394处理Huh7细胞诱导LD的融合。Huh7细胞在含有10%FCS和20 ng/ml尼罗河红的DMEM中培养，不含（对照组）或存在（F1394）10μg/ml F1394.使用奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜获取时间推移图像。箭头表示LD的融合。参见补充电影S1和S2。棒材，10μm。
图3：
图3：
ACAT抑制剂增加细胞游离胆固醇。（A） Huh7细胞按图1A所示进行处理。成立[14C] 按照材料和方法结果表明平均值±SD（n=3）[14C] 胆固醇酯形成。（B） 细胞按A处理。使用GC定量细胞游离胆固醇总量，如材料和方法. ***对< 0.001, **对< 0.02. （C） 细胞按A处理。使用GC定量细胞总胆固醇酯，如材料和方法（D）在没有（顶部）或存在（底部）10μg/ml F1394的情况下培养细胞24小时。然后用洋地黄素固定细胞并使其渗透，如材料和方法并用filipin和抗BMP/LBPA抗体双重标记。棒材，10μm。（E） 在没有（对照）或存在（F1394）10μg/ml F1394的情况下培养细胞24小时。然后通过冷冻和解冻将细胞固定并渗透，如材料和方法并被菲利宾染色。棒材，10μm。
图4：
图4：
F1394增加LDs中的游离胆固醇/胆固醇酯比率。Huh7细胞在不存在（对照）或存在10μg/ml F1394或10μg/ml 58-035的情况下培养24小时，或用LPDS中的MβCD/胆固醇（Chol）或LPDS中的MβCD/胆固醇加58-035（Chol+58-035）处理，如材料和方法制备LD组分并通过HPTLC分析脂质，如材料和方法结果表明平均值±SD(n个= 3). *对= 0.05, **对< 0.05, ***对< 0.01, ****对< 0.001.
图5：
图5：
急性游离胆固醇积累诱导泛素和自噬介导的PLIN2降解。（A） 将10μg/ml的F1394添加到Huh7细胞中。在适当的时间间隔，固定细胞，用洋地黄素渗透，并用BODIPY 493/503和抗PLIN2抗体双重标记，如材料和方法巴，10μm。（B） 按照A中的方法处理细胞。通过Western blotting测量细胞PLIN2，如材料和方法（C）如图1所示，用10μg/ml F1394、10μg/ml 58-035、LPDS（Chol）中的MβCD/胆固醇或LPDS中的M？CD/胆固醇加58-035（Chol+58-035）处理细胞24小时。在B（D）Huh7细胞中测量细胞PLIN2。在有或无10μM MG132、10μM ALLN或10 mM 3MA的情况下，用10μg/ml F1394处理细胞。培养24小时后，Western blotting显示细胞中的PLIN2。（E） Huh7细胞在没有和存在10μg/ml F1394、10μg/ml环己酰亚胺（CHX）或CHX加F1394的情况下生长18小时。PLIN2的测量与B中的一样。（F，g）细胞用10μg/mlF1394，10μg/ml-CHX或CHX+F1394处理24小时。然后用洋地黄固定细胞并渗透，并用BODIPY 493/503（F）标记或抗PLIN2抗体（G），如材料和方法.棒材，10μm。
图6：
图6：
急性游离胆固醇积累诱导载脂蛋白B与低密度脂蛋白的结合。（A） 将F1394,10μg/ml添加到Huh7细胞中。在适当的时间间隔，固定细胞，用洋地黄素渗透，并用BODIPY 493/503和抗ApoB抗体双重标记，如材料和方法巴，10μm。（B） 如图1所示，用LPDS（Chol）中的MβCD/胆固醇或LPDS中的M？CD/胆固醇加58-035（Chol+58-035）处理细胞。然后固定细胞，并按照说明标记载脂蛋白B。（C） Huh7细胞在没有（对照）或存在10μg/ml F1394的情况下培养24小时。然后将细胞均质化，并通过逐步蔗糖密度梯度分离PNS，如材料和方法通过蛋白质印迹法测量ApoB的分布。（D） Huh7细胞在没有和存在10μg/ml F1394的情况下生长24小时。然后固定细胞并用0.1%Triton X-100渗透。载脂蛋白B和PDI的细胞内分布如材料和方法巴，10μm。（E） 按照所述处理细胞，然后用50μg/ml洋地黄素固定并渗透，然后用抗ApoB和抗PDI双重标记。棒材，10μm。（F） 细胞按A培养，然后用ER跟踪器标记。棒材，10μm。（G） 细胞按D处理，用50μG/ml的洋地黄素固定并透化，然后用抗PLIN2和抗ApoB双重标记。棒材，10μm。
图7：
图7：
急性游离胆固醇积聚诱导LDs与ER的关联。（A，B）Huh7细胞用10μg/ml F1394处理6 h。然后固定细胞并在电子显微镜下进行检查，如材料和方法（B）a中虚线方形区域的高倍图像。黑色箭头表示内质网的蓄水池与LD相连。红色箭头表示与LD相连的线粒体。棒材，1μm。（C，D）按所述处理细胞，然后用抗PLIN2（5 nm）和抗ApoB抗体（10 nm，黑色箭头）固定并双重标记，如所述材料和方法。插图，虚线方块的放大图像。棒材，0.1μm。用10μg/ml F1394处理（E–H）Huh7细胞24 H。然后固定细胞并在电子显微镜下进行检查，如材料和方法。电池包含具有不同电子密度（E）的LD。LD经常连接（G）。（F） E（H）中虚线方形区域的高倍图像LD放大图像。每个LD连接到双层膜（F和H中的黑色箭头），并被微小的囊泡包围（F和H中的红色箭头）。棒材，1μm（E，G），0.1μm（F，H）。
图8：
图8：
载脂蛋白B与LDs的关联依赖于Rab18的活性。（A） 将10μg/ml的F1394添加到Huh7细胞中。在适当的时间间隔，细胞被固定，用洋地黄素渗透，并用抗PLIN2和抗Rab18抗体双重标记，如材料和方法巴，10μm。（B） 如所述用F1394处理细胞，然后匀浆，并通过如中所述的逐步蔗糖密度梯度分离PNS材料和方法用Western blotting法测定Rab18的分布。用F1394处理过度表达mCherry-PLIN2、mCherry-Rab18、mCherry-Rab18 S22N、mCherly-Rab18-Q67L和mCherry-GDI的（C，D）Huh7细胞，如材料和方法免疫荧光后计数ApoB阳性细胞数。棒材，10μm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“引用者”文章

工具书类

    1. Arguello G、Balboa E、Arrese M、Zanlungo S。胆固醇在非酒精性脂肪肝中的作用的最新见解。Biochim生物物理学报。2015;1852:1765–1778.-公共医学
    1. 阿什拉夫·努（Sheikh TA）。内质网应激和氧化应激在非酒精性脂肪肝发病机制中的作用。自由基研究2015；49:1405–1418.-公共医学
    1. Barbosa AD、Savage DB、Siniossoglou S.脂滴与微生物的相互作用：脂代谢中的新作用。当前操作细胞生物学。2015;35:91–97.-公共医学
    1. Bartz R、Li WH、Venables B、Zehmer JK、Roth MR、Welti R、Anderson RG、Liu P、Chapman KD。脂质组学揭示脂肪体储存醚类脂质并调节磷脂运输。《脂质研究杂志》，2007年；48:837–847.-公共医学
    1. Bashiri A，Tavallaee G，Li L，Ng DS。细胞胆固醇在非酒精性脂肪肝发病机制中的新作用。Curr Opin脂质。2013;24:275–276.-公共医学

出版物类型