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.2016年12月；64(6):1951-1968.
doi:10.1002/hep.28766。 Epub 2016年10月5日。

在肝细胞和星状细胞系中暴露于人类免疫缺陷病毒/丙型肝炎病毒揭示了病毒和细胞类型之间的协同促纤维化转录激活

沙迪沙龙 1, 哈辛塔·A·福尔摩斯 1, 罗希特·金达尔 2, Shyam S Bale公司 2, 辛西娅·布里萨克 1, 纳迪亚·阿拉特拉科奇 1, 安娜·利多夫斯基 1, 安妮·J·克鲁格 1, Dahlene N Fusco公司 1, 杰·路德 1, 埃斯佩兰斯·A·谢弗 1, 林文宇（Wenyu Lin） 1, 马丁·雅穆什 2, 雷蒙德·T钟 1
附属公司

在肝和星状细胞系中暴露于人类免疫缺陷病毒/丙型肝炎病毒揭示了病毒和细胞类型之间的协同纤维化转录激活

沙迪沙龙等。 肝病学. 2016年12月.

摘要

人类免疫缺陷病毒（HIV）/丙型肝炎病毒（HCV）联合感染加速进展性肝纤维化；然而，对其机制仍知之甚少。HCV和HIV在单细胞培养的肝细胞和肝星状细胞中独立诱导促纤维化标记物转化生长因子β1（TGFβ1）（由活性氧物种[ROS]介导）和活化B细胞核因子κ-轻链增强子（NFκB）；然而，它们并没有考虑到自然发生的蜂窝串扰。我们建立了一个体外共培养模型，并研究了HIV和HCV对肝纤维化的作用。在Huh7.5.1和LX2细胞中创建绿色荧光蛋白报告细胞系，该细胞系由功能性ROS（抗氧化反应元件）、NFκB和母亲对十臂停搏液同源物3（SMAD3）启动子驱动，使用跨阱产生共培养物。报告细胞系暴露于HIV、HCV或HIV/HCV。根据感染状态测量并比较3条通路的激活。还测量了细胞外基质产物（胶原蛋白1型α1（CoL1A1）和金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1））。在共培养的两种细胞系中，HCV和HIV都通过ROS（抗氧化反应元件）、NFκB和SMAD3独立激活TGFβ1信号传导。HIV/HCV共存后，这些纤维化途径的激活是附加的。这一点在检测CoL1A1和TIMP1时得到了证实，在HIV/HCV共存后的共培养LX2细胞中，信使RNA和蛋白质水平显著高于两种病毒。此外，与单细胞培养中的任何一种细胞类型相比，共培养模型中这些纤维化前基因的表达都显著更高，这表明Huh7.5.1和LX2细胞之间存在相互作用和反馈机制。

结论：HIV通过ROS、NFκB和TGFβ1上调，在肝细胞和肝星状细胞系中加重HCV驱动的促纤维化程序；肝细胞和肝星状细胞共培养显著增加CoL1A1和TIMP1的表达；我们的新型共培养报告细胞模型为研究转录性纤维化反应提供了一个有效且更真实的系统，并可能为肝纤维化提供重要的见解。（《肝病学》2016；64:1951-1968）。

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数字

图1
图1。报告细胞系的效率
使用（A）流式细胞术和（B）荧光显微镜检测新生成的Huh7.5.1和LX2报告细胞系在刺激后对ARE、NFκB和SMAD3的效率。在用适当的刺激物刺激48小时后（tBHQ用于ARE，TNFα用于NFκB，TGFβ1用于SMAD3），通过流式细胞术和荧光显微镜测量，与模拟处理的细胞相比，GFP阳性细胞的数量显著增加。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（C） NRF2、RelA和SMAD3 siRNA预处理显著降低了tHBQ、TNFα和TGFβ对报告细胞系（LX2和Huh7.5.1）的影响。用siRNA转染报告细胞系。转染后48小时，用适当的刺激物刺激细胞48小时。通过流式细胞术检测细胞。siRNA预处理显著降低了刺激后GFP阳性细胞的百分比。ARE=抗氧化反应元件；tBHQ公司=第三种-丁基对苯二酚；NFκB=核因子-κB；TNFα=肿瘤坏死因子α；SMAD3=SMAD家族成员3；TGFβ1=转化生长因子β1。
图1
图1。报告细胞系的效率
使用（A）流式细胞术和（B）荧光显微镜检测新生成的Huh7.5.1和LX2报告细胞系在刺激后对ARE、NFκB和SMAD3的效率。在用适当的刺激物刺激48小时后（tBHQ用于ARE，TNFα用于NFκB，TGFβ1用于SMAD3），通过流式细胞术和荧光显微镜测量，与模拟处理的细胞相比，GFP阳性细胞的数量显著增加。细胞核用DAPI（蓝色）复染。（C） NRF2、RelA和SMAD3 siRNA预处理显著降低了tHBQ、TNFα和TGFβ对报告细胞系（LX2和Huh7.5.1）的影响。用siRNA转染报告细胞系。转染后48小时，用适当的刺激物刺激细胞48小时。通过流式细胞术检测细胞。siRNA预处理显著降低了刺激后GFP阳性细胞的百分比。ARE=抗氧化反应元件；tBHQ公司=第三种-丁基对苯二酚；NFκB=核因子-κB；TNFα=肿瘤坏死因子α；SMAD3=SMAD家族成员3；TGFβ1=转化生长因子β1。
图2
图2。共培养跨阱模型示意图
将支持HCV感染的Huh7.5.1细胞接种到较大的底部跨孔中，将肝星状细胞（LX2）接种到较小的上部跨孔中。分隔两个微孔的膜具有0.4微米的多孔性，允许两种细胞类型之间的分泌分子自由交换。然后将HCV和/或HIV添加到培养基中，MOI为3。MOI=感染的多重性
图3
图3。模拟治疗、HCV暴露、HIV暴露和HIV/HCV共同暴露72小时后在LX2细胞和Huh7.5.1细胞中诱导ARE应答基因
用流式细胞术（A）GFP阳性细胞百分率测定ARE反应基因的激活；（B） 通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的geoMFI；和（C）磷酸化NRF2。C部分的上面板显示磷酸化NRF2（P-NRF2）、总NRF2和β肌动蛋白蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板描述了暴露于HCV和/或HIV 72小时后P-NRF2与总NRF2比率的密度测定量化。*P<0.05**P<0.005 HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒；GFP=绿色荧光蛋白；geoMFI=几何荧光强度；ARE=抗氧化反应元件；P-NRF2=磷酸化NRF2
图4
图4。模拟治疗、HCV暴露、HIV暴露和HIV/HCV共同暴露72小时后，HCV和HIV共同暴露诱导LX2细胞和Huh7.5.1细胞中NFκB应答基因
NFκB应答基因的诱导通过流式细胞术测定GFP阳性细胞的百分比（A）；（B） 流式细胞术检测GFP阳性细胞的geoMFI；和（C）磷酸化RelA。C部分的上部面板显示磷酸化RelA、总RelA和βActin蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板描述了暴露于HCV和/或HIV 72小时后P-RelA与总RelA的比率的密度测定定量。*P<0.05 HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒；GFP=绿色荧光蛋白；geoMFI=几何荧光强度；P-RelA=磷酸化RelA
图5
图5
在模拟治疗、HCV暴露、HIV暴露和HIV/HCV共同暴露72小时后，HIV增强了共同培养模型中SMAD3应答基因的HCV诱导。流式细胞术检测SMAD3应答基因激活率（A）GFP阳性细胞百分率；（B） 流式细胞术检测GFP阳性细胞的geoMFI；和（C）磷酸化SMAD3。C部分的上面板显示了磷酸化SMAD3、总SMAD3和β肌动蛋白蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板描述了暴露于HCV和/或HIV 72小时后P-SMAD3与总SMAD3之比的密度测定量化。*P<0.05 HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒；GFP=绿色荧光蛋白；geoMFI=几何荧光强度；P-SMAD3=磷酸化SMAD3
图6
图6
诱导（A）CoL1A1 mRNA表达的比较；（B） TIMP1 mRNA表达；（C） CoL1A1和TIMP1蛋白水平。C部分的上面板显示了暴露于HCV和/或HIV感染72小时后，LX2和Huh7.5.1细胞中CoL1A1和TIMP1细胞内蛋白水平的典型western blot。C部分的下面板显示了暴露于HCV和/或HIV 72小时后，归一化CoL1A1和TIMP1蛋白水平对β-肌动蛋白的密度定量；（D） 单细胞培养和与Huh7.5.1细胞共培养pHSC中CoL1A1和TIMP1 mRNA表达诱导的比较。*P<0.05**P<0.005 CoL1A1=胶原蛋白，I型，α1；TIMP1=金属蛋白酶组织抑制剂-1；HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒
图6
图6
诱导（A）CoL1A1 mRNA表达的比较；（B） TIMP1 mRNA表达；（C） CoL1A1和TIMP1蛋白水平。C部分的上图显示暴露于HCV和/或HIV感染72小时后，LX2和Huh7.5.1细胞中CoL1A1和TIMP1的细胞内蛋白水平的代表性蛋白质印迹。C部分的下面板显示了暴露于HCV和/或HIV 72小时后，归一化CoL1A1和TIMP1蛋白水平对β-肌动蛋白的密度定量；（D） 单细胞培养和与Huh7.5.1细胞共培养pHSC中CoL1A1和TIMP1 mRNA表达诱导的比较。*P<0.05**P<0.005 CoL1A1=胶原蛋白，I型，α1；TIMP1=金属蛋白酶组织抑制剂-1；HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒
图7
图7。在单培养和共培养模型中，HIV增加了Huh7.5.1细胞对HCV感染的耐受性，但在共培养模型下，HCV耐受性进一步增加
HCV耐受性通过（A）细胞内HCV RNA水平（RT-PCR）和（B）HCV核心蛋白水平（western blot）测定。B部分的上面板显示了Huh7.5.1细胞内HCV核心蛋白水平的典型western blot。B部分的下面板显示了归一化HCV核心蛋白水平到β-肌动蛋白的密度定量，其中HCV单感染单培养被视为1倍变化。Huh7.5.1细胞在单培养或在跨孔共培养系统中添加LX2报告细胞系的情况下暴露于HCV和/或HIV 72小时。HCV=丙型肝炎病毒；HIV=人类免疫缺陷病毒
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