Cancer-Associated Fibroblasts in Pancreatic Cancer Are Reprogrammed by Tumor-Induced Alterations in Genomic DNA Methylation

doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3264

.2016年9月15日；76(18):5395-404.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3264。 Epub 2016年8月5日。

胰腺癌中癌相关成纤维细胞通过肿瘤诱导的基因组DNA甲基化改变而重新编程

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¹浙江大学医学院第二附属医院，中国杭州。浙江大学医学院，杭州，中国。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。
²马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。
^三马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院斯基普·维拉胰腺癌研究和临床护理中心。
⁴马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科。
⁵马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌中心。
⁶浙江大学医学院，杭州，中国。
⁷马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院斯基普·维拉胰腺癌研究和临床护理中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌中心。lzheng6@jhmi.edu。

PMID： 27496707
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胰腺癌中癌相关成纤维细胞通过肿瘤诱导的基因组DNA甲基化改变而重新编程

钱晓等。癌症研究. 2016.

.2016年9月15日；76(18):5395-404.

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¹浙江大学医学院附属第二医院，杭州，中国。浙江大学医学院，杭州，中国。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。
²马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。
^三马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院斯基普·维拉胰腺癌研究和临床护理中心。
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⁵马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌中心。
⁶浙江大学医学院，中国杭州。
⁷马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院肿瘤系。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院西德尼·金梅尔癌症中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院斯基普·维拉胰腺癌研究和临床护理中心。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科。马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌中心。lzheng6@jhmi.edu。

PMID： 27496707
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摘要

基质纤维化是胰腺导管腺癌（PDAC）的一个显著组织学特征，但基质成纤维细胞如何在肿瘤微环境（TME）中调节以支持肿瘤生长尚不清楚。在这里，我们发现PDAC细胞可以诱导癌相关成纤维细胞（CAF）中的DNA甲基化。在与PDAC细胞直接接触时，在基线时缺乏SOCS1甲基化的间充质干细胞或CAF中诱导SOCS1和其他基因的DNA甲基化。沉默或去甲他滨治疗以阻断DNA甲基化酶DNMT1抑制SOCS1的甲基化。相反，CAF中SOCS1基因甲基化和下调激活STAT3并诱导胰岛素样生长因子-1表达以支持PDAC细胞生长。此外，CAF促进小鼠PDAC肿瘤异种移植物的甲基化依赖性生长。具有SOCS1甲基化的患者衍生CAF促进PDAC生长的能力比没有SOCS1基因甲基化的CAF更强。总的来说，我们的结果揭示了PDAC细胞如何重新编程CAF以修改TME中的肿瘤-基质相互作用，从而促进恶性生长和进展。癌症研究；76(18); 5395-404. ©2016 AACR版权所有。

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利益冲突声明

潜在利益冲突作者未披露任何潜在利益冲突。

数字

**图1。*SOCS1系列*胰腺癌相关成纤维细胞中经常甲基化**
A、候选基因选择过程的模式。B、通过甲基化特异性PCR（MSP）在3对初级PDAC细胞和CAF中检查所示8个基因的启动子甲基化状态（补充表2）。C、在所述的7例人类PDAC标本的石蜡包埋载玻片上进行SOCS1的IHC（41）。显示了同一张幻灯片中具有代表性的肿瘤旁区域（上面板）和肿瘤内区域（下面板）的IHC图像。在上面板中，箭头表示正常的腺泡细胞；在下面板中，箭头指示PDAC肿瘤细胞。在两个面板中，箭头表示基质成纤维细胞。比例尺，20µm。D、如前所述，蛋白质表达通过图像分析软件（Aperio）量化为基质中阳性染色信号的总像素数除以基质的总面积大小（42）。通过配对t检验对瘤内基质（肿瘤基质）和瘤旁正常基质（正常基质）进行比较（p=0.0487）。E、，*SOCS1系列*甲基化通过MethySYBR实时PCR定量。*SOCS1系列*实时RT-PCR（qPCR）定量mRNA表达；和*GAPDH公司*用于标准化。*SOCS1系列*mRNA表达与*SOCS1系列*启动子甲基化在简单线性回归分析中（p=0.021）。

**图2。*SOCS1系列*与胰腺癌细胞共培养诱导CAF甲基化**
A、 CAF/肿瘤共培养和CAF纯化的实验方案。*SOCS1系列*检测了从3.30CAFs和1.30Tumor共培养物中纯化的原代成纤维细胞3.30CAF、1.30Tomor和CAFs中的甲基化。*SOCS1系列*甲基化通过常规MSP在该面板中进行测量，并通过MethySYBR在其余面板中进行量化。B、，*SOCS1系列*用qPCR法定量3.30CAFs和从3.30CAF和1.30肿瘤共培养物中纯化的CAFs的mRNA表达；和*GAPDH公司*用于标准化。C、，*SOCS1系列*和*ST14标准*分别在从Panc10.05肿瘤和MSC共培养纯化的MSCs和成纤维细胞中检测甲基化。*SOCS1系列*用qPCR检测mRNA表达。D中，*SOCS1系列*分别在Panc10.05Tumor-MSC共培养和SW620Tumor-MS共培养纯化的成纤维细胞中检测甲基化。E、，*SOCS1系列*从Panc09.05Tumor-MSC共培养（MSC+09.05T）或Panc09.015Tumor-09.05CAF共培养（09.05F+09.05T）中分离的成纤维细胞中未检测到甲基化，但在Panc10.05Tumor-MSC共培养（MS+10.05T）和Panc10.05 Tumor-09.05CAF共同培养（09.0105T）中检测到了甲基化。

**图3。诱导*SOCS1系列*MSCs的甲基化需要肿瘤细胞和MSCs之间的直接细胞间接触**
A、横穿系统示意图。B、无诱导*SOCS1系列*用新鲜肿瘤条件培养基（TCM）、10倍浓缩TCM培养的MSCs甲基化，或在非接触共培养中，其中MSC和Panc10.05肿瘤细胞由肿瘤细胞无法通过的1µM半透明膜分离。C、 MSCs和Panc10.05肿瘤细胞通过1µM或8µM半透明膜分离。Panc10.05接种在1µM膜上的肿瘤细胞不能诱导*SOCS1系列*骨髓间充质干细胞的甲基化接种在底部培养箱中。Panc10.05通过8µM膜迁移的肿瘤细胞可以诱导*SOCS1系列*第6天及之后MSCs甲基化。D、第6天及之后，8µM孔膜上的Panc10.05T细胞（下面板）迁移至底部腔室。Panc10.05T细胞（上面板）无法通过1µM孔膜迁移。比例尺，20µm。

**图4。DNMT1调节*SOCS1系列*甲基化导致*SOCS1系列*STAT3的表达和后续激活以及IGF-1的诱导表达**
慢病毒载体shRNA靶向*DNMT1（DNMT1）*（第页*DNMT1（DNMT1）*)用于敲低DNMT1的表达（补充图S2）。*GAPDH公司*表达用于所有qPCR结果的归一化。A、的表达式*DNMT1（DNMT1）*,*DNMT3a型*和*DNMT3b公司*用qPCR检测骨髓间充质干细胞与Panc10.05肿瘤（10.05T）共培养24小时前后的变化。B、将10.05T共培养前后骨髓间充质干细胞中DNMT1的表达与敲除细胞因子*DNMT1（DNMT1）*.C、，*SOCS1系列*用MethySYBR检测骨髓间充质干细胞与10.05T共培养前后的甲基化，并与敲除*DNMT1（DNMT1）*.D、，*SOCS1系列*将10.05T共培养前后MSCs中的表达与DNMT1敲除后MSCs中表达进行比较。E、，*SOCS1系列*将10.05T共培养前后MSCs的甲基化与DAC预处理的MSCs进行比较。F、，*胰岛素样生长因子-1*qPCR检测10.05T共培养前后骨髓间充质干细胞的表达，并与敲除*DNMT1（DNMT1）*如图3所示，将.G、MSCs与Panc10.05肿瘤细胞在8µM跨壁系统中共培养5天。将底部室中的细胞固定，并使用识别Pan-CK的FITC-偶联抗体进行双重免疫荧光染色，以标记上皮性肿瘤细胞（绿色）和PE-偶联抗体，用于STAT3或p-STAT3（Tyr705）（红色），并使用DAPI对细胞核进行反染色（蓝色）。比例尺，20µm。H、，*SOCS1系列*用MethySYBR检测10.05T共培养前后转染对照microRNA的MSCs和转染miR-29b的MSCs的甲基化情况。在A–F&H中，通过显示p值的双尾非配对学生t检验进行比较分析。

**图5。CAF中的DNA甲基化和SOCS1下调对支持小鼠PDAC生长至关重要**
A、在一个具有代表性的实验中，接种Panc10.05肿瘤后第5周采集的异种移植瘤体积测量。10.05T，小鼠单独接种Panc10.05肿瘤（n=4）；10.05T+小鼠/DAC、DAC预处理小鼠接种10.05T（n=4）；10.05T+MSC，10.05T与接种在未处理小鼠上的MSCs混合（n=4）；10.05T+MSC/DAC，10.05T与经DAC预处理的MSCs混合（n=8）。B、比较10.05T+MSC组（n=16）和10.05T+MSC/DAC组（n=17）的无瘤生存率。C、显示了从A中的实验中收获的肿瘤。红色周期表示没有肿瘤。四个最大的肿瘤显示为10.05T+MSC/DAC组的代表。D、接种Panc10.05肿瘤后第7周采集的异种移植瘤体积测量。10.05T+MSC-ctrl，10.05T与MSCs混合用于shRNA转导（n=10）；10.05T+MSC-ctrl/DAC，10.05T与MSCs混合用于shRNA转导，并用DAC预处理（n=10）；10.05T+MSC-shSOCS1系列/DAC，10.05T与MSCs混合，用靶向SOCS1的shRNA转导，并用DAC预处理（n=16）。E、在D.10.05T+MSC-ctrl（n=20）和10.05T+MSC-ctrl/DAC（n=2 0）中比较各组的无瘤生存率，p=0.009；10.05T+MSC-shSOCS1系列/DAC（n=21）vs.10.05T+MSC-ctrl/DAC（n=20），p=0.1204。F、显示了四个最大的肿瘤作为D中每组的代表。G、比较单独接种10.05T或与不同患者来源CAF联合接种的NOD-SCID小鼠组的无瘤生存率。10.05T，小鼠单独接种10.05T；10.05T+9.28F，接种10.05T和CAF9.28F的小鼠；10.05T+10.29F，接种10.05T和CAF 10.29F的小鼠；10.05T+2.01F，接种10.05T和CAF 2.01F的小鼠；CAF，仅代表性CAF样本。N=每组10人。10.05T+10.29F vs.10.05T，p=0.017；10.05T+2.01F vs.10.05T，p=0.044；10.05T+9.28F vs.10.05T，p=0.217。所有实验重复两次。在A&D中，比较采用双尾非配对学生t检验进行分析；在B、E、G中，通过Log-rank（Mantel-Cox）检验进行比较分析。

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1. Wolfgang CL、Herman JM、Laheru DA、Klein AP、Erdek MA、Fishman EK等。胰腺癌的最新进展。CA癌症临床杂志。2013;63:318–348.-项目管理咨询公司-公共医学
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