跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2016年8月；11(8):1554-71.
doi:10.1038/nprot.2016.088。 Epub 2016年7月28日。

用于结构研究的最佳热稳定膜蛋白的诱变和筛选策略

弗朗西丝卡·马格纳尼 1, 玛丽亚·塞拉诺·维加 1, 本的设计师柴田阳子 1, 萨巴·阿卜杜勒·胡辛 1, 纪尧姆·勒本 1, 詹妮弗·米勒·加拉赫 1, 安基塔·辛哈尔 1, 安妮特·斯特雷奇 1, 詹妮弗·A·托马斯 1, 克里斯托弗·泰特 1
附属公司

用于结构研究的最佳热稳定膜蛋白的诱变和筛选策略

弗朗西丝卡·马格纳尼等。 Nat协议。 2016年8月。

摘要

整体膜蛋白（MP）在洗涤剂溶液中的热稳定性是一个关键参数，它决定了获得适用于结构测定的衍射良好晶体的可能性。然而，许多哺乳动物MP太不稳定，无法结晶。我们开发了一种基于系统诱变和放射性配体结合热稳定性分析的热稳定策略，该方法可应用于受体、离子通道和转运体。对含有300个氨基酸（aa）残基的G蛋白偶联受体（GPCR）进行热稳定需要约6-12个月的时间。由此产生的热稳定MP更容易结晶，从而形成高质量的结构。这种方法有助于基于结构的药物设计应用于GPCR，因为可以确定与低亲和力配体结合的热稳定受体的多种结构。就如何开发MP的热稳定性分析以及如何结合突变以获得适合结构研究的最佳稳定突变，给出了协议和建议。该程序中的步骤包括通过Ala/Leu扫描突变产生～300个定点突变，通过瞬时转染在哺乳动物细胞中表达每个突变，并使用基于（125）I标记放射配体与未纯化的结合的热稳定性分析鉴定耐热突变，洗涤剂溶解的MP。然后将单独的热稳定点突变组合在一起，制成最稳定的MP，适用于结构生物学和其他生物物理研究。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明了相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1
说明恒温策略的流程图。
图2
图2
HEK293细胞瞬时转染的优化。在优化程序的第一步中，用表达3种不同MPs融合GFP的不同数量质粒转染HEK293（TetR）细胞，用1μg/ml四环素诱导，转染24小时后通过荧光显微镜观察：A和B、apelin受体（APJR）、0.3μg和3μg质粒；C&D、促肾上腺皮质激素释放因子受体（CRF1R）、0.1和3.0μg质粒；E&F、5-羟色胺转运体（SERT）、0.3和1μg质粒。通过测试不同数量的四环素和诱导时间，进一步优化SERT和APJR，以最小化细胞内错误折叠聚集物的数量。CRF1R的所有测试条件都导致了类似的细胞表面表达模式，没有出现错误折叠的蛋白。比例尺代表10μm。
图3
图3
不同格式的热稳定性分析。
图4
图4
5-羟色胺转运体热稳定性测定方法的开发。（a） 初始分析，以确定哪种放射性配体可用于热稳定性分析。将放射性配体以高于其K值10倍的浓度添加到细胞中D类在存在或不存在冷竞争物（1 mM可卡因）的情况下孵育1小时，然后在4℃下将SERT溶解在1%wt/vol DDM中。将裂解产物通过自旋柱，并测定流动中的放射性配体数量（SERT结合）。125I-RTI55给出了在存在或不存在可卡因的情况下测量的结合放射性配体之间的最佳比率。（b） 将等分的细胞与125I-RTI55，然后用不同浓度的DDM溶解，如图所示。溶解后，将样品在不同温度下加热30分钟，在冰上骤冷，并测定结合的放射性配体的量。表观T米SERT随洗涤剂用量变化：1%wt/vol DDM，表观T米25ºC；0.1%wt/vol DDM，表观温度米28ºC；0.01%wt/vol DDM，表观温度米31ºC。注意，0.01%wt/vol DDM可能无法完全溶解膜，这可能导致两相曲线；这些条件不会用于膜蛋白的热稳定。
图5
图5
β的热稳定性1-肾上腺素能受体。（a） 将每种受体变体的样品分成两个试管，并在4℃下保存或在32℃下加热30分钟。将每个突变体的热稳定性与野生型受体进行比较（50%，虚线）。将最耐热的突变体（箭头）相互结合使用，以生成最佳耐热突变体。发现六个耐热突变（红色箭头）产生一个高度稳定的突变（β1AR-m23）已结晶并与许多不同配体结合。一种超耐热突变体β1AR-JM50包含另外三个耐热突变，包括I129V（蓝色箭头），其在LCP中结晶，产生与氰哌啶醇结合的2.1º分辨率结构。图改编自Serrano-Vega等（b）β的热稳定性比较1AR（黑色方块）和β1AR-m23（绿色圆圈）。这两种受体在DDM中溶解并在没有放射性配体的情况下加热。图改编自Tate&Schertler。
图6
图6
腺苷A的热稳定性2安培受体在激动剂结合构象中。（a） 将16个最耐热的基因系统地组合在一起，形成三个突变体a2安培R-GL23。将最耐热的单突变（突变A，绿色菱形）与接下来的15个最稳定的突变（B-P）结合，并测定其稳定性（蓝色菱形）。然后将最稳定的双突变体（突变体AB，深蓝色菱形）与添加突变结合，添加突变也提高了突变体A的热稳定性（预测的T米与实验T相似米)产生三个突变体（红钻石），其中最稳定的是突变体ABF。在本文中，突变体A为GL0，突变体AB为GL10，突变体ABF为GL23。（b） DDM-可溶性A的热稳定性2安培R突变体与三将H-NECA与野生型受体进行比较，得出以下明显的T米s： WT（黑圈），29ºC；GL0（绿色方块），42ºC；GL10（蓝色三角形），47ºC；GL23（红色倒三角形），50ºC。图改编自Lebon等人。
图7
图7
超稳定β的热稳定性1AR突变体JM50。在各种不同的洗涤剂中测量了热稳定性（表观温度米括号内）：黑色正方形，DDM（61ºC）；灰色三角形，DM（52ºC）；红色圆圈，NG（37ºC）；紫色钻石，SDS（34℃）；橙色方块，OG（27ºC）；绿色三角形，HTG（23ºC）。洗涤剂浓度均为2%wt/vol，SDS除外，SDS为1%wt/vol大肠杆菌图改编自Miller&Tate。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Bill RM等。克服膜蛋白结构测定的障碍。国家生物技术。2011;29:335–340.-公共医学
    1. Drew D、Lerch M、Kunji E、Slotboom DJ、de Gier JW。使用GFP融合优化膜蛋白过表达和纯化。自然方法。2006;3:303–313.-公共医学
    1. Drew D等。一种基于GFP的可扩展管道，用于膜蛋白过表达筛选和纯化。蛋白质科学。2005年；14:2011–2017.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Hattori M，Hibbs RE，Gouaux E.用于膜蛋白预结晶筛选的荧光检测尺寸排除色谱热稳定性分析。结构。2012;20:1293–1299.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kawate T，Gouaux E.用于整体膜蛋白预结晶筛选的荧光检测尺寸排除色谱法。结构。2006;14:673–681.-公共医学

出版物类型