Aging of mice is associated with p16(Ink4a)- and β-galactosidase-positive macrophage accumulation that can be induced in young mice by senescent cells

doi:10.18632/aging.100991

.2016年7月；8(7):1294-315.

doi:10.18632/aging.100991。

小鼠衰老与p16（Ink4a）和β-半乳糖苷酶阳性巨噬细胞蓄积有关，这些巨噬细胞蓄积可由衰老细胞在年轻小鼠中诱导

附属公司

¹Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203。
²美国纽约州布法罗市罗斯韦尔公园癌症研究所细胞应激生物学系，邮编：14263。

PMID： 27391570
预防性维修识别码：项目经理4993332
内政部： 10.18632/aging.100991

小鼠衰老与p16（Ink4a）和β-半乳糖苷酶阳性巨噬细胞蓄积有关，这些巨噬细胞蓄积可由衰老细胞在年轻小鼠中诱导

布兰登·M霍尔等。老龄化（纽约奥尔巴尼）. 2016年7月.

.2016年7月；8(7):1294-315.

doi:10.18632/aging.100991。

附属公司

¹Everon Biosciences，Inc.，美国纽约州布法罗14203。
²美国纽约州布法罗市罗斯韦尔公园癌症研究所细胞应激生物学系，邮编：14263。

PMID： 27391570
预防性维修识别码：项目经理4993332
内政部： 10.18632/aging.100991

摘要

衰老细胞被认为是与年龄相关的慢性无菌全身炎症的来源，也是抗衰老治疗的靶点。为了了解SCs数量的控制机制，我们分析了植入SCID小鼠体内的人衰老成纤维细胞快速清除的现象，当SCs嵌入海藻酸钠珠中以防止其受到免疫细胞攻击时，可以克服这一现象。为了确定可能的SC杀手，我们分析了灌洗液中细胞群的含量以及围绕SC珠形成的胶囊。SCs分泌因子吸引的主要细胞类型之一是巨噬细胞亚群，其特征是p16（Ink4a）基因表达和pH6.0（β-gal（pH6））时的β-半乳糖苷酶活性，因此类似于SCs。一贯地，具有p16（Ink4a）启动子驱动的荧光素酶的小鼠在植入包埋在海藻酸盐珠中的SC后两周内腹膜腔产生明亮的发光。p16（Ink4a）/β-gal（pH6）表达细胞具有巨噬细胞F4/80的表面生物标志物，并且对用于选择性杀伤吞噬细胞的氯膦酸脂质体敏感。同时，氯膦酸盐不能杀死基因毒性应激在体外产生的真正SC。组织中p16（Ink4a）/β-gal（pH6）阳性细胞比例升高的老年小鼠在接受系统性氯膦酸盐治疗后，两种细胞均减少，这表明以前被认为是SC的细胞中有很大一部分实际上是巨噬细胞的一个亚类。这些观察结果表明，p16（Ink4a）/β-半乳糖（pH6）阳性巨噬细胞在衰老过程中发挥着重要作用，而衰老之前仅归因于SCs。它们需要重新解释根除p16（Ink4a）/β-gal（pH6）阳性细胞后恢复活力作用的潜在机制，并重新考虑抗衰老治疗的潜在细胞靶点。

关键词：时间老化；氯膦酸盐；炎症；炎症；p16INK4a；衰老相关β-半乳糖苷酶；衰老相关分泌表型。

PubMed免责声明

利益冲突声明

声明A.P.、O.B.C.和A.V.G.是Everon Biosciences的联合创始人和股东。

数字

**图1。SC植入体内**
(**A-B公司**)具有荧光素酶（p16）半合子p16（Ink4a）敲除的年长小鼠队列（n=5只）中的生物发光信号积累^LUC公司老鼠；第16页^墨水4a/Luc). (A类)描述了单个小鼠的全身发光（总通量；p/s）。(B)年代老化小鼠的连续生物发光成像。色标表示信号强度（所有时间点的阈值相同）。(**C-D公司**)SCI小鼠SC植入模型。将含有分泌型GLuc报告子结构（NDF-GLuc）的NDF细胞作为微载体微珠培养物腹腔内植入SCID小鼠，在注射之前，这些微珠培养液在低血清（0.2%FBS）中培养以诱导静止（Qui-NDF）或在20Gy照射以诱导衰老（Sen-NDF）。或者，用海藻酸盐保护凝胶（Sen-NDF+Alg）包被辐照的NDF。通过测量28天定期收集的小鼠血浆中的GLuc活性来监测NDF-GLuc存活动力学。细胞接种后24小时，血液中残留的GLuc活性以血浆中活性的百分比表示。所示值为各组（n=4-6只小鼠/组）的平均值±SEM。第7天之后，各组之间的差异具有统计学意义（p≤0.001）。(D类)空藻酸盐珠（无细胞）和含有嵌入式辐射诱导衰老NDF的藻酸盐珠的显微照片（亮场图像）。将衰老的NDF细胞包埋到小鼠体内后，在植入小鼠体内之前，通过用钙调素AM（绿色）标记活细胞和用碘化丙啶（PI；红色）标记死细胞来评估包埋细胞的活性，然后进行荧光显微镜观察。还评估了海藻酸钠珠中衰老NDF的β-半乳糖^pH值6染色。显示代表性图像（放大100倍）。存活率>90%（PI-阳性细胞<10%）表明细胞植入成功。

**图2。β-gal的积累^pH值6-和p16（Ink4a）阳性免疫细胞对SC植入的反应**
(A类)整颗藻酸盐珠的图像体外从腹腔取出p16后（空的或含有SC）^LUC公司老鼠。通过相位对比光显微镜（顶面板）或DNA染色试剂盒（CyQUANT™Direct）染色样品的荧光显微镜（中面板）观察海藻酸钠珠周围的致密包裹细胞层，以观察活细胞内的细胞核。β-加仑^pH值6染色显示包裹SC包埋海藻酸钠珠的细胞的活性（放大100倍）。(B)用Geimsa对冷冻保存的SC包埋海藻酸钠珠的组织切片（15-μm）进行染色，以通过放大100倍和400倍的光学显微镜（分别为左上和右上面板）显示组织学，用F4/80免疫荧光（绿色）显示巨噬细胞，显示该外膜定位蛋白的特异性染色（左下面板；放大400倍），以及β-半乳糖^pH值6通过X-Gal基底与核固红复染（400倍放大）进行活性。显示含有SCs的海藻酸凝胶（Alg）。(C)生物发光体内p16的成像^LUC公司腹腔接种空藻酸盐珠（empty）或藻酸盐包埋SCs（Sen）的小鼠。珠粒注射前两天（基线）和注射后第5天和第12天获得的代表性序列图像显示，患有SC的小鼠的发光信号增加。彩色刻度表示最小和最大阈值的相对发光信号强度，以辐射度表示。红色箭头表示藻酸盐珠植入造成的注射部位伤口。(D类)SC注射后第12天的生物发光量表示为来自腹部的总通量（p/s），表示为与基线测量值相比信号增加的倍。(E类)通过流式细胞术对表面标记物免疫染色的活细胞进行分析，分析接种后2-3周收集的携带SC的小鼠腹腔灌洗液的细胞成分。描述了主要细胞类型的百分比：巨噬细胞（Mac）、B淋巴细胞（B细胞；B）、嗜酸性粒细胞（Eos）和剩余细胞群（Rest）。该分析描述了一个典型的实验(**电子-G**)其中这4个细胞群通过FACS分离并检测荧光素酶活性(F类)和β-半乳糖活性(**G公司**)，标准化为单元格编号。用于FACS的选通方案如补充图S1所示。所示值为各组（n=3-6只小鼠/组）折叠诱导的平均值±SEM。

**图3。巨噬细胞的药理清除体内消耗萤光素酶和β-gal^pH值6p16的活性^LUC公司携带SC的小鼠**
(A类)代表性序列图像体内p16的生物发光^LUC公司小鼠在接种空珠状物（empty）或海藻酸钠包埋的SC后12天（治疗前）和两次腹腔注射含有PBS对照物（Veh）或氯膦酸盐（Clod）的脂质体后一周（治疗后；接种后18-20天）获得。彩色标尺表示最小和最大阈值的相对发光信号强度，以辐射度表示。(B)治疗后各组腹部的发光量（总通量；p/s）表示为与治疗前测量的信号相比的倍数差。(C)从幼年小鼠、携带空珠的脂质体载剂处理小鼠（Em/Veh）或携带SC的脂质体载体或氯膦酸盐处理小鼠（分别为Sen/Veh和Sen/Clod）的腹腔灌洗中回收的细胞总产量。(D类)通过流式细胞术对免疫染色细胞进行评估，携带SCs的治疗小鼠腹腔灌洗液中的巨噬细胞数量表示为CD45阳性细胞群中存在的F4/80阳性细胞的百分比。对治疗后整个灌洗液的细胞裂解液进行荧光素酶活性分析(E类)和β-半乳糖^pH值6活动(F类)，标准化为单元格编号。所示值为平均值+/-SEM（n=3-7只小鼠/组）。ns=无统计学意义，p>0.05；n.d.=不可检测，所示值表示所分析的每个细胞数的检测极限（定义为背景读数的2倍）。

**图4。氯膦酸钠治疗耗尽p16（Ink4a）阳性和β-半乳糖^pH值6-来自按时间顺序老化的p16的阳性细胞^LUC公司老鼠**
(A类)年轻人（13周）与老年人（90周）腹部生物发光基线读数p16^LUC公司小鼠（n=5和17只/组）。几何平均值显示在图表上。(**B-C）**根据腹部生物发光将老年小鼠随机分为3组（每组5-6只）：PBS治疗组、PBS中的载脂脂质体（Veh）或氯膦酸脂质体（Clod）。在两次氯膦酸盐治疗后（静脉注射，前三天和静脉注射，发光测量前一天）测量腹部的生物发光。(B)p16的代表性序列图像^LUC公司小鼠在治疗方案前后呈现发光（以发光度表示）。彩色标尺表示最小和最大阈值的相对发光信号强度，以辐射度表示。(C)来自治疗p16腹部的发光信号量（总通量；p/s）^LUC公司小鼠表示为与治疗前测量值相比的倍差。几何平均值显示在图表上。(D类)从载体和氯膦酸盐脂质体处理的90周龄p16中收集白色脂肪组织（iWAT和vWAT）的腹股沟和内脏（性腺周）堆积物^LUC公司小鼠和β-gal染色^pH值6活动。展示了具有代表性的照片。(E类)β-gal的代表性光学显微镜图像（放大200倍）^pH值6-染色的内脏脂肪组织用核固红复染。脂肪细胞之间的细胞（以核染色的存在为标志）为β-半乳糖^pH值6-负值（白色箭头）或-正值（黑色箭头）。这些细胞在氯膦酸钠处理小鼠的大区域中完全缺失（如图所示）。(F类)β-gal的代表性图像^pH值6-小鼠脂肪间充质干细胞p16的染色培养^LUC公司小鼠早期传代（p1培养）或20Gyγ射线照射后10天（衰老）。β-半乳糖SCs染色阳性^pH值6并且在形态上与早期传代不同。(**G公司**)使用50μg/mL氯膦酸盐脂质体（Clod）或类似的载体脂质体（Veh）或PBS（未处理）稀释液（1:100）隔夜（20小时）后衰老的mAdMSCs的相差光学显微镜图像，表明没有观察到细胞死亡或对这些细胞的影响。

**图5。假设模型示意图体内p16（Ink4a）/β-gal的积累^pH值6-自然老化生物体中的阳性细胞**
在年轻哺乳动物中（顶面板），p16（Ink4a）/β-gal分泌SASP^pH值6-阳性SCs有助于吸引有效靶向和破坏SCs所需的先天免疫成分。SC分泌物激活招募的巨噬细胞，诱导p16（Ink4a）/β-gal^pH值6-阳性表型。成功根除SCs后，炎症因子消退，组织内稳态恢复。这种分辨率导致p16（Ink4a）/β-gal的损失^pH值6-当具有这种表型的巨噬细胞被清除或释放其激活状态时，组织中的阳性细胞。然而，在老年动物中（底部面板），先天免疫损伤导致无法有效识别或破坏SC。这导致由SCs和SC-相关巨噬细胞（SAM）分泌产物诱导的慢性炎症的形成。SAM的积累可能是未解决的先天免疫反应的一种表现，导致慢性无菌全身炎症，这是衰老生物体的典型特征。

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中的注释

衰老相关巨噬细胞和“巨噬细胞衰老”：它们是同一个谜的碎片吗？
普拉蒂奇佐·F、博纳费·M、奥利维耶里·F、弗朗西斯科·C。 Pratchizzo F等人。老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2016年12月7日；8(12):3159-3160. doi:10.18632/aging.101133。老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2016 PMID：27941213 免费PMC文章。没有可用的摘要。
阿尔茨海默病中的巨噬细胞功能障碍：“巨噬细胞衰老”之谜的另一块？
Costarelli L、Malavolta M、Giacconi R、Provinciali M。 Costarelli L等人。老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2017年8月5日；9（8）：1865-1866年。doi:10.18632/aging.101276。老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2017 PMID：28783709 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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1. Larbi A、Franceschi C、Mazzatti D、Solana R、Wikby A、Pawelec G。免疫系统老化是人类寿命的预测因素。生理学（贝塞斯达）2008；23:64–74.-公共医学
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