Genome-wide analysis of HIF-2α chromatin binding sites under normoxia in human bronchial epithelial cells (BEAS-2B) suggests its diverse functions

doi:10.1038/srep29311

.2016年7月4日6:29311。

doi:10.1038/srep29311。

常氧条件下人类支气管上皮细胞（BEAS-2B）HIF-2α染色质结合位点的全基因组分析表明其具有多种功能

李孟昌¹, 黄信儒², 张子豪^三, 谢长煌^2 4, 谢申元¹, 陈一秀⁵, 周伟元⁵, 乔·希·蒋⁶, 青黄来⁷, Chia-Yang Shiau先生^1 5 7

附属公司

¹台湾台北国防医学中心医学研究生院，11490。
²台湾台北成新总医院麻醉科。
^三台北医科大学生物医学信息学研究生院，台北，11031台湾。
⁴台湾台北国防医学中心药理学系，11490。
⁵台湾台北国防医学中心生物化学系及研究生院，11490。
⁶台湾台北国防医学中心药学院，11490。
⁷台湾台北国防医学中心公共卫生学院，11490。

PMID： 27373565
PMCID公司：项目经理4931692
内政部： 10.1038/srep29311

常氧条件下人类支气管上皮细胞（BEAS-2B）HIF-2α染色质结合位点的全基因组分析表明其具有多种功能

李孟昌等。科学代表. 2016.

.2016年7月4日6:29311。

doi:10.1038/srep29311。

作者

李孟昌¹, 黄信儒², 张子豪^三, 谢长煌^2 4, 沈远燮¹, Yi Siou Chen（陈一秀）⁵, 周伟元⁵, 乔·希·蒋⁶, 青黄来⁷, Chia-Yang Shiau先生^1 5 7

附属公司

¹台湾台北国防医学中心医学研究生院，11490。
²台湾台北成新总医院麻醉科。
^三台北医科大学生物医学信息学研究生院，台北，11031台湾。
⁴国防医学中心药理学系，台北，11490台湾。
⁵台湾台北国防医学中心生物化学系及研究生院，11490。
⁶台湾台北国防医学中心药学院，11490。
⁷台湾台北国防医学中心公共卫生学院，11490。

PMID： 27373565
PMCID公司：项目经理4931692
内政部： 10.1038/srep29311

摘要

最近在正常氧条件下的癌症和干细胞系中发现了具有组成功能的HIF-2α。在这项研究中，BEAS-2B是一种支气管上皮细胞系，它在常压下组成性表达活性HIF-2α，并显示出多能性标记，包括Oct-4、Nanog和球体形成。在常氧下敲低HIF-2α后，Oct-4表达降低。HIF-2α的全球富集分析表明，在常氧条件下，HIF-2β具有多种功能。对富集位点的生物信息学分析揭示了HIF-2α结合位点的增强子作用，HIF-2β相互作用蛋白的参与，以及富集的从头基序，表明HIF-2γ在假缺氧中的不同作用。在缺氧条件下，发现的基因座与癌细胞系786-O（16.1%）和MCF-7（15.9%）中的基因座重叠的比率很低，这表明存在普遍的非规范机制。低氧对ChIP-PCR分析中所选位点的富集有积极、边际或不利影响。HIF-2αN末端激活域（N-TAD）的缺失扰乱了ELN和ANKRD31注释的两个位点的报告活性。缺氧引起HIF-2α的丰度变化可能会通过C-TAD激活将N-TAD功能误认为是典型的缺氧诱导特征。阐明组成型HIF-2α的假缺氧功能有助于解决其在恶性肿瘤和多能性中的作用。

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数字

**图1。多能性相关标记的表达和BEAS-2B在常压下的球形培养。**
(一)western blotting检测常压下BEAS-2B细胞核中HIF-2α的表达。β-微管蛋白和TATA结合蛋白（TBP）分别用作胞质溶胶和细胞核部分的蛋白质标记。(b条)10月4日的蛋白质印迹。(**c（c）**)为了敲低HIF-2α，用靶向HIF-2α的shRNA转染BEAS-2B细胞，并使用sh-Luc作为对照。(d日)Nanog的Western blotting和含有浮球的BEAS-2B培养物。给出了两个或三个实验的代表性结果。

**图2。常压下BEAS-2B中HIF-2αChIP-seq峰的分布。**
(一)图示HIF-2α结合位点基因组位置的饼图。(b条)根据基因组区域到TSS的距离，显示区域-基因关联百分比的条形图，该距离由基因组区域注释工具（GREAT）计算得出(http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/).

**图3。用ChIP-PCR分析HIF-2α的染色质富集。**
(一)利用半定量PCR进一步验证了ChIP-Seq分析提供的HIF-2α的代表性富集。数据以相对于输入DNA（100%）的信号的形式呈现**P（P）* < 0.05和***P（P）* < 0.01与阴性对照。(b条)确认的富集物进一步用氯化钴进行缺氧模拟处理₂（150μM）。抗HIF-2α或P300的抗体使用相同的引物对。用与输入DNA相对的半定量PCR信号计算缺氧与常压的相对折叠结合。使用图像J估计所有值（平均值±SD，n=3）。

**图4。对IL10、PPP2R3A、ELN和ANKRD31注释的富集位点进行报告者分析。**
使用携带或不携带IL10、PPP2R3A、ELN或ANKRD31富集位点序列的Cypridina luc报告质粒进行检测。Cypridina荧光素酶活性归一化为红色萤火虫荧光素酶活性。(一)在常氧条件下，BEAS-2B中的荧光素酶活性与空载体有关。(b条)低氧（150μM CoCl2处理）和常压之间的相对荧光素酶活性。(**c（c）**–**（f）**)当报告质粒在Addgene的单独表达质粒中与HEK293中的HIF-2α变异体共同转染时的相对荧光素酶活性。M2是一个稳定的全长HIF-2α突变体，dN或dC分别是N-TAD或C-TAD截断的HIF-2β。数据显示为平均值±SD，n=3**P（P）*<0.05; ***P（P）* < 0.01和****P（P）*<0.001与对照组。

**图5。HIF-2α结合基序分析。**
单核苷酸的HIF-2α结合谱(一)或二核苷酸(b条)使用RSAT生成的成分(**c（c）**)MEME在常压下产生的三个最重要的HIF-2α结合基序。(d日)脉宽调制工具用于扫描HOCOMOCO的EPAS1基序1和ARI3A基序2，对照BEAS-2B和786-O(**e（电子）**)常压下HIF-2α潜在异二聚体结合基序的分析。结果由RSAT中的二元分析生成。显著性指数（sig）由“sig=−log10（E值）”和E值=P值×被测性状数计算。值越大，误差越小。*，*从头开始*与数据库中任何已知DNA结合蛋白不匹配的结合基序。(**（f）**)在PDXK注释的峰ID 151上HIF-1α和SP-1的共富集。

**图6。BEAS-2B中HIF-2α注释基因的GO和通路分析。**
(一)利用DAVID对GO进行分析，采用基因本体/GOTERM_BP_FAT。折叠富集度>1.5，P值、Bonferroni和FDR<0.05被设定为分析标准。(b条)根据−log值（P值）显示了IPA和前20位的通路分析。

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参考文献

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[2] Wiesener M.S.等人。低氧诱导内皮细胞PAS域蛋白-1：表征和与低氧诱导因子-1α的比较。《血液》92，2260–2268（1998）。-公共医学

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[4] Covello K.L.等人。HIF-2alpha调节Oct-4：缺氧对干细胞功能、胚胎发育和肿瘤生长的影响。Genes Dev 20，557–570，doi:10.1101/gad.13999906（2006）。-内政部-项目管理委员会-公共医学

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