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.2016年7月1日；8(7):729-44.
doi:10.15252/emmm.201505925。 打印2016年7月。

内质网应激通过IRE1α介导的miR-150和XBP-1剪接的降解增强纤维化

Femke Heindryckx公司 1, 弗朗索瓦·比奈 1, 马凯拉·蓬蒂科斯 2, 克里斯塔·隆布茨 三, 刘乔伊（Joey Lau） 1, 约翰·克鲁格 1, 帕尔·格温 4
附属公司

内质网应激通过IRE1α介导的miR-150和XBP-1剪接的降解增强纤维化

Femke Heindryckx公司等。 EMBO分子医学. .

摘要

内质网应激导致未折叠蛋白反应的激活，并与纤维化疾病的发展有关。在本研究中，我们表明，使用抑制剂4μ8C抑制内质网应激诱导的IRE1α信号通路，可阻断TGFβ诱导的体外肌成纤维细胞活化，减少体内肝和皮肤纤维化，并恢复从系统性硬化患者分离的活化肌成纤维母细胞的纤维化表型。通过使用IRE1α（-/-）成纤维细胞和缺乏内核糖核酸酶活性的IRE1β突变体蛋白的表达，我们证实了IRE1在肌成纤维细胞激活过程中起着重要作用。IRE1α可以切割miR-150，从而释放miR-150通过c-Myb对αSMA表达的抑制作用。对IRE1α的抑制也被证明通过XBP-1依赖性途径阻断ER扩张。综上所述，我们的结果表明，内质网应激可能是纤维化发病机制中一个重要且保守的机制，内质网膜应激途径的组成部分可能与治疗纤维化疾病的患者有关。

关键词：内质网应激；纤维化；肝硬化；肌成纤维细胞；硬皮病。

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数字

图1
图1。这个RN公司酶活性愤怒激活肌成纤维细胞需要1α

  1. αSMA mRNA中的级别TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞和爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.001.

  2. 胶原蛋白1α2信使核糖核酸中的级别TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.01.

  3. 信使核糖核酸的级别急诊室应激相关基因TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞*P（P） CHOP公司 = 0.045, *P（P）Bip=0.023*P（P）拼接的XBP公司‐1P（P）=0.001，与相应的对照组相比。

  4. 蛋白质印迹CHOP公司蛋白质水平TGF公司β处理的高频激光1个单元格±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C。

  5. 显示拼接和未拼接的琼脂糖凝胶XBP公司‐1信使核糖核酸在里面TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C。

  6. α的免疫组织化学染色座椅模块组件在里面TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C。比例尺=20μm。

  7. 分泌可溶性胶原蛋白的定量TGF公司β处理的高频激光1个单元格±爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 0.049.

  8. αSMA mRNA中的表达式TGF公司β处理的高频激光1个细胞过表达2个RN公司酶死亡突变体（K599A和K907A）爱尔兰共和国1α. *P（P）K599A=0.013*P（P）K907A=0.0008与重量.

  9. αSMA mRNA中的表达式TGF公司β处理的爱尔兰共和国1α−/−或重量MEF单元格*对= 0.025.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给出了值。误差条表示s.e.m。n个= 3英寸（A–C）和（G–I）。可在线获取此图的源数据。
图2
图2。miR‐150具有抗纤维化作用，可直接被爱尔兰共和国1α

  1. miR‐150水平TGF公司β处理的高频激光1成纤维细胞和爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*P（P）= 与对照组相比为0.046。

  2. miR‐150水平HFL公司1成纤维细胞过度表达2RN公司酶死亡突变体（K599A和K907A）爱尔兰共和国1α. *P（P）= 0.0043（K599A），P（P）= 0.043（K907A），与对照组相比。

  3. miR‐150水平TGF公司β处理的重量(爱尔兰共和国1α+/+)和愤怒1α−/− MEF公司单元格*P（P）= 0.018. 结果表示为与Ctrl相比的折叠变化。

  4. miR‐150水平爱尔兰共和国1α−/− MEF公司未被转染的细胞(美国犹他州)或转染mi核糖核酸抑制剂控制（siCtrl）或miR‐150‐5p mi核糖核酸抑制剂*P（P）= 0.034与美国犹他州.

  5. αSMA mRNA中的表达式TGF公司β处理的爱尔兰共和国1α−/− MEF公司未被转染的细胞(美国犹他州)或转染mi核糖核酸抑制剂控制（siCtrl）或miR‐150‐5p mi核糖核酸抑制剂*P（P）= 0.043与美国犹他州.

  6. miR‐150在高频激光1用对照质粒（Ctrl）或miR-150表达质粒（miR-150）转染成纤维细胞*P（P）= 0.038.

  7. c-Myb蛋白的Western blotTGF公司β处理的高频激光1个未转染的成纤维细胞(美国犹他州)，用对照质粒转染(保时捷中心trl）或miR-150表达质粒（miR-150）*对= 0.0206英寸美国犹他州Ctrl与超声心动图β和P（P）= 0.0126英寸保时捷中心trl控制与保时捷中心trl公司TGF公司β.

  8. α的蛋白质印迹座椅模块组件在与（G）相同的实验装置中*P（P）= 0.0405英寸美国犹他州Ctrl与超声心动图β、 和P（P）= 0.0284英寸保时捷中心trl控制与保时捷中心trl公司TGF公司β.

  9. c‐我的信使核糖核酸未转染水平高频激光1个单元格(美国犹他州)和转染对照si的细胞核糖核酸（siCtrl）或si核糖核酸针对c‐Myb（sicMyb）*P（P）= 0.00001与美国犹他州.

  10. αSMA mRNA未转染的表达HFL公司1个单元格(美国犹他州)和转染对照si的细胞核糖核酸（siCtrl）或带有si核糖核酸针对c‐Myb（sicMyb）*P（P）= 0.0042英寸美国犹他州Ctrl与超声心动图β.

  11. 假定爱尔兰共和国根据序列分析，miR‐150中的1α解理位点用箭头表示。

  12. 体外重组卵裂试验爱尔兰共和国1α和miR‐150（左）或XBP公司‐1（右）。

  13. miR‐150表达于高频激光‐1个用TGF公司β在不存在4μ8C的情况下，然后用放线菌素D（ActD）处理4和24小时*P（P）= 0.027与TGF公司β.

数据信息：使用Student’st吨测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。n个=3英寸（A–E，G–J，M）和n个=4英寸（F）。可在线获取此图的源数据。
图EV1
图EV1。miR-29和miR-148的水平不受4μ8C治疗的影响
误差条表示s.e.m。n个= 4.
图3
图3。急诊室肌成纤维细胞的扩张与XBP公司‐1拼接

  1. 分析急诊室尺寸英寸高频激光1个成纤维细胞用TGF公司β在没有（Ctrl）或爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C，或in高频激光1个细胞转染了si核糖核酸控制si核糖核酸（siCtrl）或带有si核糖核酸瞄准XBP公司‐1（硅XBP公司‐1). 这个急诊室用可视化急诊室追踪红和细胞核用Hoechst染色（左，标尺=20μm）或用电子显微镜染色（右，标尺=200 nm），其中红线标记急诊室.

  2. 量化急诊室（A）中实验装置中相对于原子核的尺寸*P（P）= 按Ctrl键为0.0001，和*P（P）= 0.0223英寸。

  3. XBP公司‐1信使核糖核酸未转染的表达高频激光1个单元格(美国犹他州)以及在用对照si转染的细胞中核糖核酸（siCtrl）或si核糖核酸瞄准XBP公司‐1（硅XBP公司‐1). *P（P）= 0.0001.

  4. 胶原蛋白水平TGF公司β处理的高频激光1按（C）所述转染成纤维细胞*P（P）= 0.005.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。n个=3英寸（B、C）和n个=4英寸（D）。
图4
图4。药物抑制爱尔兰共和国1α减轻肝纤维化

  1. The effect of the爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C开启科科斯群岛我4C57诱导的肝纤维化BL公司/组织学测量的6只小鼠美他韦分数。Ctrl键(n个 = 8); 控制键+4μ8C(n个 = 6);科科斯群岛我4(n个 = 6);科科斯群岛我4+4μ8摄氏度(n个 = 8). *P（P）= 0.0077.

  2. 代表性肝组织切片用天狼星红染色以检测胶原蛋白（顶部）和α座椅模块组件（底部）。比例尺=50μm。

  3. α的百分比座椅模块组件‐（A）中实验装置中小鼠肝脏中央周围区域的阳性细胞*P（P）= 0.036.

  4. （A）中实验装置的肝与体重比*P（P）= 0.0031. Ctrl键(n个= 8); 控制键+4μ8C(n个= 6); CCl公司4(n个= 6); CCl公司4+4μ8摄氏度(n个= 8).

  5. 商业保险信使核糖核酸小鼠肝组织中的表达如（A）所示*P（P）= 0.020. Ctrl键(n个= 5); 控制键+4μ8C(n个= 5); CCl公司4(n个= 5); CCl公司4+4微米8厘米(n个= 5).

  6. 显示拼接和未拼接水平的典型凝胶XBP公司‐1来自对照组和科科斯群岛我4诱导的肝硬化小鼠和4μ8C治疗的效果。

  7. miR‐150在小鼠肝组织中的表达（A）*P（P）= 与未经处理的对照组相比，为0.032。Ctrl键(n个= 5); 控制键+4μ8C(n个= 5); CCl公司4(n个= 5); CCl公司4+4μ8摄氏度(n个= 5).

  8. αSMA mRNA从小鼠肝脏分离的原代星状细胞中的水平，然后用或不用TGF公司β±4μ8C*P（P）= 0.031,n个 = 3.

  9. 商业保险信使核糖核酸从小鼠肝脏分离的原代星状细胞中的水平，然后用或不用TGF公司β±4μ8C*P（P）= 0.008,n个 = 3.

  10. 小鼠原代肝星状细胞BiP（顶部）或α染色的显微图像座椅模块组件（底部）。比例尺=20μm。

  11. Western blot显示BiP蛋白在原代小鼠肝星状细胞中的表达。

  12. 量化信使核糖核酸表达水平CTGF公司原代人肝星状细胞中的胶原蛋白TGF公司β±4μ8C。

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确表示P（P）‐给定的值。错误栏表示此图的s.e.m.源数据可在线获取。
图EV2
图EV2。活化的肝星状细胞表达UPR（不间断电源）肝纤维化的标志物

  1. 的代表性图像科科斯群岛我4C57诱导的肝硬化BL公司/6只小鼠。肝脏与抗‐α共染色座椅模块组件和抗BiP抗体。比例尺=50μm。

  2. 抗‐α共染肝脏的代表性图像座椅模块组件和反CHOP公司抗体。比例尺=50μm。

图5
图5。抑制爱尔兰共和国1α减少皮肤纤维化

  1. The effect of the愤怒1α抑制剂4μ8C开TGF公司β诱导C57皮肤纤维化BL公司/6只小鼠，通过皮下天狼星红区的百分比进行测量。Ctrl键(n个 = 6); 控制键+4μ8C(n个 = 5);TGF公司β (n个 = 8);TGF公司β+4μ8C(n个 = 8). *P（P）= 0.046.

  2. 代表性皮肤组织切片用天狼星红染色以检测胶原蛋白（顶部）和α座椅模块组件（底部）。比例尺=50μm。

  3. α的百分比座椅模块组件‐（A）中实验装置小鼠皮下的阳性细胞*P（P） = 0.024.

  4. 激光捕获显微切割所选区域的代表性图像（比例尺=100μm）。

  5. α的表达水平SMA mRNA在激光捕获显微切割获得的皮下组织样本中。控制(n个=5），Ctrl+4μ8C(n个 = 5),TGF公司β (n个 = 5),TGF公司β+4μ8C(n个 = 5). *P（P）= 0.044.

  6. 如（E）所示，相同样本中的miR‐150表达水平。

  7. α的免疫组织化学染色座椅模块组件在用TGF公司β±4μ。比例尺=20μm。

  8. αSMA mRNA小鼠原代皮肤成纤维细胞经TGF公司β±4μ8C*P（P）= 0.049,n个 = 4.

  9. 显示拼接和未拼接水平的琼脂糖凝胶XBP公司‐1在按照指示处理的原代小鼠皮肤成纤维细胞中TGF公司β和4μ8C。

  10. 商业保险信使核糖核酸小鼠原代皮肤成纤维细胞经TGF公司β在4μ8C的存在和不存在下*P（P）= 0.00007用于TGF公司β与Ctrl和P（P）= 0.00002用于TGF公司β与TGF公司β+4μ8C。n个 = 4.

  11. 蛋白质印迹显示CHOP公司按指示处理的原代小鼠皮肤成纤维细胞的蛋白表达TGF公司β和4μ8C。

  12. miR‐150信使核糖核酸按指示处理的原代小鼠皮肤成纤维细胞中的水平TGF公司β和4μ8C*P（P）= 0.00031与未经处理的对照组相比，n个 = 3.

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。错误栏表示此图的s.e.m.源数据在线可用。
图EV3
图EV3。肌成纤维细胞表达UPR（不间断电源）皮肤纤维化的标志物

  1. 对照组或4μ8C处理的C57皮肤的代表性图像BL公司/6只老鼠TGF公司β诱导的皮肤纤维化。皮肤切片与anti-α共染色座椅模块组件和抗BiP抗体。比例尺=50μm。

  2. 小鼠皮肤与抗‐α共染色的代表性图像座椅模块组件和反CHOP公司抗体。比例尺=50μm。

图6
图6。抑制爱尔兰共和国1α逆转硬皮病患者肌成纤维细胞的纤维化表型

  1. CTGF mRNA皮肤中的表达水平(分布式支持系统c） 和肺(LSS公司c） 从硬皮病患者中分离成纤维细胞并用爱尔兰共和国1α抑制剂4μ8C*对= 0.018适用于分布式支持系统c（c）(n个=6）和P（P）= 0.003适用于LSS公司c（c）(n个 = 3).

  2. 胶原蛋白1α2信使核糖核酸与（A）中相同样本中的表达水平*P（P）= 0.0030适用于分布式支持系统c和P（P）= 0.0036适用于LSS公司c。

  3. 定量（A）中相同样品中的胶原蛋白水平*P（P）= 0.010.

  4. 免疫组织化学染色检测经4μ8C治疗或未经治疗的硬皮病患者分离的成纤维细胞中的BiP蛋白。比例尺=20μm。

  5. 信使核糖核酸α水平座椅模块组件从囊性纤维化患者中分离的原发性肺成纤维细胞(穿越火线)、慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺病)或哮喘*P（P）= 0.00001用于哮喘与健康对照，以及P（P）= 哮喘患者的ctrl值为0.00003，对照组为4μ8C。

  6. 量化信使核糖核酸与（E）中相同样品中BiP的水平*P（P）= 哮喘与健康对照组之间为0.0023对= 哮喘患者成纤维细胞的4μ8C治疗和对照治疗之间的0.0031。

数据信息：使用Student’st吨‐测试。显著差异用*和精确数字表示P（P）给定值。误差条表示s.e.m。n个=3英寸（E，F）。
图7
图7。角色模型爱尔兰共和国肌成纤维细胞激活中的1α
如果没有急诊室应激，miR‐150抑制c‐Myb表达以防止c‐Myb诱导的α座椅模块组件表达式。急诊室例如，由于纤维化刺激而产生的压力会激活爱尔兰共和国1α直接裂解和灭活miR‐150，导致c‐Myb表达增加，从而导致α表达增加座椅模块组件以及肌成纤维细胞的激活。此外，爱尔兰共和国1α介导的XBP公司‐1信使核糖核酸导致急诊室细胞外基质蛋白的扩张和分泌能力增强。抑制内核糖核酸酶活性爱尔兰共和国1α乘以4μ8C将导致miR‐150水平增加，随后c‐Myb和α降低座椅模块组件水平。用4μ8C处理也会减少XBP公司‐1剪接，急诊室基质蛋白的产生、扩增和分泌。
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