Hedgehog signaling promotes basal progenitor expansion and the growth and folding of the neocortex

doi:10.1038/nn.4307

.2016年7月；19(7):888-96.

doi:10.1038/nn.4307。 Epub 2016年5月23日。

刺猬信号促进基底祖细胞扩张和新皮质的生长和折叠

王磊（Lei Wang）^1 2, 侯石蕊^1 2, 年轻的古汉^1 2

附属公司

¹美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院发育神经生物学系。
²美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院脑瘤研究部。

PMID： 27214567
预防性维修识别码：项目经理4925239
DOI（操作界面）： 10.1038/nn.4307

刺猬信号促进基底祖细胞扩张和新皮质的生长和折叠

王磊（Lei Wang）等。自然神经科学. 2016年7月.

.2016年7月；19(7):888-96.

doi:10.1038/nn.4307。 Epub 2016年5月23日。

作者

王磊（Lei Wang）^1 2, 侯石蕊^1 2, Young-Gou Han（韩永国）^1 2

附属公司

¹美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院发育神经生物学系。
²美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院脑瘤研究部。

PMID： 27214567
预防性维修识别码：项目经理4925239
DOI（操作界面）： 10.1038/nn.4307

摘要

人类独特的智力来源于巨大的扩张和折叠的新皮质，这反映了神经祖细胞的扩张，特别是包括基底放射胶质细胞（bRGs）和中间祖细胞（IPCs）在内的基底祖细胞。我们发现，组成性活跃的Sonic hedgehog（Shh）信号扩大了bRGs和IPCs，并在其他光滑的小鼠新皮质中诱导折叠，而Shh信号的丢失则减少了bRG和IPC的数量以及新皮质的大小。SHH信号在人类胎儿新皮质中强烈活跃，但在小鼠胚胎新皮质中不强烈活跃，并且阻断人类大脑器官中的SHH信号可减少bRG的数量。从机制上讲，Shh信号转导增加了小鼠bRGs的初始生成和自我更新以及IPC的增殖，并增加了人类大脑类器官bRGs初始生成。因此，人类胎儿新皮质中强大的SHH信号可能有助于bRG和IPC的扩张以及新皮质的生长和折叠。

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竞争性金融利益

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

**图1。*烟雾M2*诱导新皮质扩张和折叠**
a。控制和*GFAP:：Cre；烟雾2^{佛罗里达州/+}*(*烟雾2*突变）P10的大脑。b。对照组和对照组的尼塞尔染色*烟雾2*第7页的脑切片。箭头表示白质延伸至诱导的脑回。比例尺=1 mm。图片表示至少重复5次。c。层特异性标记的表达：Satb2（层II–IV）、Ctip2（官方名称Bcl11b，红色，层V）、Tbr1（绿色，层VI）和DAPI（蓝色）。比例尺=0.2毫米。图片至少代表3次重复。d。根据P7对照组和*烟雾2*突变体。与对照组相比，结果被归一化为折叠变化。双尾未配对t吨-测试，*P（P）*=0.0380，每组3只小鼠。尽管样本数对于正态性检验来说太少，但我们还是假设了正态分布。F方差检验，*P（P）*=0.3510，F（2,2）=4.697。**e、。**扣带回和内侧皮质细胞密度的量化。双尾未配对t吨-测试，*P（P）*=0.0006（饱和2），*P（P）*=0.3634（Ctip2），*P（P）*=0.0250（Tbr1）；t（10）=4.877（饱和度2），t（10；n=9个脑片，每组3只小鼠。所有数据均通过了Kolmogorov–Smirnov（KS）正态性检验(*P（P）*>0.1）和F方差检验*P（P）*=4.255（饱和2），*P（P）*=0.8609（Ctip2），*P（P）*=0.2070（Tbr1）；F（5,5）=0.1380（饱和2），F（5,15）=1.179（Ctip2），F[5,5]=3.385（Tbr1）**P<0.05；*****P（P）*< 0.001. 误差线表示标准偏差。

**图2。*烟雾2*扩展IPC和bRG（oRG）**
a。E16.5皮质标记RG标记Pax6（红色）和IPC标记Tbr2（绿色）。细虚线划分了内侧（M）和背侧（D）皮质。粗虚线表示VZ和SVZ之间的边界。Pax6⁺Tbr2型⁻Tbr2条带从VZ分离的细胞⁺IPC细胞计数为bRGs（oRGs；白色箭头表示示例）。图片代表至少6次重复。**b、 c。**Pax6的量化⁺Tbr2型⁻RGs和Tbr2⁺E16.5双尾非配对IPCt吨-测试（aRG，IPC，SVZ IPC，等方差）或双尾非配对t吨-Welch校正检验（bRG，不等方差），*P（P）*=0.7888（aRG_M），*P（P）*=0.2648（aRG_D），*P（P）*=0.0003（bRG_M），*P（P）*=0.0001（bRG_D），*P（P）*=0.0017（IPC_M），*P（P）*=0.0458（IPC_D），*P（P）*=0.0000（SVZ IPC_M），*P（P）*=0.0000（SVZ IPC_D）；t（14）=0.2730（aRG_M），t（14。所有数据均通过了Kolmogorov–Smirnov（KS）正态性检验*P（P）*> 0.1. bRG未通过等方差F检验，*P（P）*=0.6628（aRG_M），*P（P）*=0.1556（aRG_D），*P（P）*=0.0003（bRG_M），*P（P）*=0.0369（bRG_D），*P（P）*=0.2378（IPC_M），*P（P）*=0.6396（IPC_D），*P（P）*=0.7069（SVZ IPC_M），*P（P）*=0.1388（SVZ-IPC_D）；F（7，7）=1.408（aRG_M），F（7，7）=3.127（aRG_D），F（7，7）=28.04（bRG_M），F（7，7）=5.603（bRG_D），F（6，7）=2.596（IPC_M），F（6，7）=1.441（IPC_D），F（6，7）=1.336（SVZ IPC_M），F（6，7）=3.350（SVZ IPC_D）。N=每组3只小鼠的8个脑切片**d、 e、。**E16.5在E13.5注射三苯氧胺后，皮质标记有Pax6（绿色）和Tbr2（蓝色）。中的虚线(d日)指示放大的区域(**e（电子）**).f、。bRGs（td番茄）的量化⁺第6页⁺Tbr2型⁻). 双尾未配对t吨-用韦尔奇的修正进行测试，*P（P）*=0.0051，t（6）=4.300。所有数据均通过了Kolmogorov–Smirnov（KS）正态性检验，*P（P）*> 0.1. F等方差检验，*P（P）*=0.0059，F（6,4）=3.350。N=5（对照）和7(*烟雾2*)每组3只小鼠的脑切片。纳秒，*P（P）*>0.05**P<0.05；****P<0.01；*****P（P）*< 0.001. IZ，中间带；SVZ，室下区；VZ，心室区。比例尺=50μm in(一,d日)，25μm英寸(**e（电子）**). 误差条表示平均值的标准误差。

**图3。*烟雾2*通过增加bRGs（oRGs）的自我更新和改变aRG（vRG）向bRG产生的分裂角度来扩展bRGs（oRGs）**
a。实验方案和E16.5皮层标记为Pax6（蓝色）、Tbr2（绿色）、BrdU（灰色）和EdU（红色）。右侧放大了方框区域。图片表示至少重复3次。b。增殖定量（EdU⁺)和自我更新（EdU⁺溴化铀⁺)RG和IPC。从每组3只小鼠的8个脑切片中收集的所有数据均通过了Kolmogorov–Smirnov（KS）正常测试，*P（P）*> 0.1. 对于增殖研究，双尾非配对t吨-试验用于aRGP（P）=0.2680，t（14）=1.154；对于bRG，*P（P）*=0.0103，t（14）=2.960；对于IPC，*P（P）*=0.0001，t（14）=15.75。等方差F检验，用于aRG，*P（P）*=0.5533，F（7，7）=1.594；对于bRG，*P（P）*=0.3659，F（7，7）=2.045；对于IPC，*P（P）*=0.1751，F（7，7）=2.963。对于bRG的自我更新，双尾非配对t吨-使用了韦尔奇修正测试，*P（P）*=0.0056，t（9）=3.618；F方差检验*P（P）*=0.0274，F（7，7）=6.245。对于IPC的自我更新，双尾非配对t吨-使用了测试，*P（P）*=0.0001，t（14）=5.321；F方差检验*P（P）*=0.0869，F（7,7）=4.013。c。EdU距离分布⁺心室表面的bRGs。曼·惠特尼试验，*P（P）*=0.0001，秩和=1392，10540，Mann-Whitney U=571.5，n=40用于控制，n=114用于*烟雾2*.N=每组3只小鼠的8个脑切片。**d、 e。**标记为TuJ1（蓝色）、Pax6（绿色）和Tbr2（红色）的E15.5皮层(d日)和量化(**e（电子）**). 图片表示至少重复3次。对于VZ中TuJ1的相对密度，Mann-Whitney试验，*P（P）*=0.0006，秩和=134，37，Mann-Whitney U=1.000，n=10和8（对照组）*烟雾2*3对小鼠的大脑切片。对于VZ中RG和IPC的比率，Mann-Whitney检验，*P（P）*=0.0021，秩和=28，77，Mann-Whitney U=0.000，n=每组3只小鼠的7个脑切片。**f、 g、。**E14.5处的有丝分裂aRG标记为磷酸-维生素（P-Vim，绿色）和DAPI（蓝色）(**（f）**)以及分割角度的量化(克). 我们盲目分析了101个细胞(*烟雾2*突变体）和来自3对小鼠的71个细胞（对照）。在**（f）**，α表示顶面（虚线）和分割平面（实线）之间的角度。如果60°<α≤90°，则分度称为“水平”；如果30°<α≥60°，则称为“斜分度”；如果0°≤α≤30°，则命名为“垂直”。曼·惠特尼试验，*P（P）*=0.0092，秩和=6937，7769，Mann-Whitney U=2719。纳秒，*P（P）*> 0.05; **P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.005; ****P（P）*< 0.001. 误差条表示平均值的标准误差。刻度条代表50μm(一,d日)和5微米(**（f）**).

**图4。表达SMOM2的逆转录病毒在克隆水平上促进bRG的产生**
a。显示不同类型克隆示例的缩微照片。用GFP（绿色）、Pax6（红色）和Tbr2（蓝色）标记皮层，以确定细胞在培养48小时（E15）或72小时（E16）后的命运*子宫内*在E13脑室内注射GFP或SMOM2 GFP逆转录病毒。克隆定义如下：IPC/N克隆包含IPC和/或神经元，但不包含RG；aRG+IPC/N克隆有一个aRG和IPC/N；2aRG+IPC/N克隆具有两个具有或不具有IPC/N的aRG；并且bRG克隆具有至少一种bRG和其他细胞类型。比例尺=20μm。b。E16处单个克隆的组成。X轴上标记上方的每个垂直细胞列代表一个克隆。c。克隆类型的分布。在E15中，我们发现对照组中有23个IPC/N、23个aRG+IPC/N和4个2aRG+PCC/N克隆，而在*SMOM2型*在E16中，我们在对照组中发现35个IPC/N、26个aRG+IPC/N，2个2aRG+ICP/N和3个bRG克隆，在对照组发现31个IPC/N、36个aRG+IPC/N,11个2aRG+IPC/N-和23个bRG-克隆*SMOM2型*.双侧Fisher精确测试，*P（P）*=0.0823，E15（50个GFP克隆，61个SMOM2 GFP克隆），或卡方检验，*P（P）*=0.1659，在E15处，Chi-square（2）=3.593；卡方检验，*P（P）*=0.0002，在E16（66个GFP克隆，101个SMOM2 GFP克隆），奇方（2）=17.61。

**图5。*平滑（Smo）*需要扩展IPC、bRG和上层神经元**
a。E16.5皮质标记为Pax6（红色）和Tbr2（绿色）。圆圈表示Pax6的示例⁺Tbr2型⁻bRG。比例尺=50μm。我们分析了每组3只小鼠的9个切片。b条RG的量化。Mann-Whitney试验，用于media aRG，*P（P）*=0.5076，秩和=93.50，77.50，Mann-Whitney U=32.50；对于背部aRG，*P（P）*=0.3401，秩和=97，74，Mann-Whitney U=29.00；对于内侧bRG，*P（P）*=0.0005，秩和=122，49，Mann-Whitney U=4.000；用于背侧bRGP（P）=0.0002，秩和=124，47，Mann-Whitney U=2.000。c。IPC的量化。Mann-Whitney试验，用于医疗IPC，*P（P）*=0.0188，秩和=112，59，Mann-Whitney U=14.00；用于背部IPC，*P（P）*=0.0078，秩和=115，56，Mann-Whitney U=11.00。d。非水平划分aRG的量化（0°≤α≤60°）。我们盲目分析了144个细胞(*平滑（Smo）*突变体）和190个细胞（对照），每组3只小鼠的7个切片。双尾未配对t吨-用Welch校正进行测试，*P（P）*=0.0124，t（7）=3.343；F方差检验，*P（P）*=0.0088，F（6，6）=11.18。**e、。**层特异性标记的表达和量化：Satb2（红色）、Ctip2（蓝色）和Tbr1（绿色）。比例尺=0.2 mm。双尾不成对t吨-测试：对于Tbr1，*P（P）*=0.0000，t（16）=5.244；对于Ctip2，*P（P）*=0.0271，t（16）=2.432；对于Satb2，*P（P）*=0.0000，t（11）=7.947。N=9节，每组3只小鼠。所有数据均通过了Kolmogorov–Smirnov（KS）正态性检验，*P（P）*>0.1，并通过F检验进行等方差检验：*P（P）*=0.4990，F（8,8）=1.642（Tbr1），*P（P）*=0.0701，F（8,8）=3.928（Ctip2），*P（P）*=0.0418，F（8,8）=4.719（饱和2）。纳秒，*P（P）*> 0.05; **P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.005; ****P（P）*< 0.001. 误差条表示平均值的标准误差(**b-d（英国）**)和标准偏差(**e（电子）**).

**图6。人类aRGs中的强SHH信号**
a。 *GLI1型*人类胎儿发育过程中的表达（左）和*GLI1型*和*Gli1公司*发育中人类和小鼠皮层的表达水平（右）。b。H&E染色和就地杂交*GLI1型*（紫色圆点）在14pcw的人胎脑中。下面放大了方框区域。比例尺=500μm和50μm（放大图像）。图像表示来自3个独立组织样本的结果。c。14pcw的人胎脑用抗SHH抗体（绿色）和DAPI（紫色）染色。与SHH肽共培养可阻断心室表面强烈的SHH染色。这种抗SHH抗体特异性染色了小鼠小脑中表达SHH的Purkinje细胞。面板中最右侧图形的比例尺=200μm(**c（c）**)其余为20μm。每个图表示两个不同组织样本上至少重复3次。

**图7。SHH信号通路促进人脑类器官bRG的产生**
a。用磷酸-维生素A（P-VIM，红色）和DAPI（蓝色）染色的大脑类器官中aRG的“水平”（60°<α≤90°）、“倾斜”（30°<α≥60°）和“垂直”（0°≤α≤30°）分裂示例，以及分裂角的量化。我们对来自3个独立实验的每组15个有机物的123（DMSO）、133（SAG）和135（SANT-1）细胞进行了盲分析。Mann-Whitney试验，DMSO与SANT-1，*P（P）*=0.0007，秩和=14080，19590，Mann-Whitney U=6330；DMSO与SAG，P=0.2681，秩和=1533617817，Mann-Whitney U=7586。比例尺=5μmb。PAX6（绿色）和TBR2（紫色）标记的人类大脑类器官和bRGs的定量（PAX6⁺待定2⁻从致密PAX6分离的细胞⁺TBR2延伸的单元格⁺用虚线表示的单元格）。我们分析了来自3个独立实验的11个（DMSO）、13个（SAG）和15个（SANT-1）类有机物中的21个（DMMO）、20个（SAG-1）和21个（SATT-1）VZ/SVZ结构。Mann-Whitney试验，DMSO与SANT-1，*P（P）*=0.000，秩和=627.5，275.5，Mann-Whitney U=44.50；DMSO与SAG，*P（P）*=0.2565，秩和=485，376，Mann-Whitney U=166.0。比例尺=50μm。c。标记为纤毛标记物（ARL13B，红色）、SMO（绿色）和DAPI（蓝色）的类器官aRG顶面，以及含有SMO的纤毛的定量。比例尺=2μm。我们检测了来自两个独立实验的4个（DMSO）、3个（SANT-1）、3个（SAG）类器官的294个（DMSO）、292个（SANT-1）和400个（SAG）纤毛，其中145个（DMSO）、53个（SANT-1）和190个（SAG）纤毛含有SMO。双侧Fisher精确测试，*P（P）*=0.0001（DMSO与SANT-1），*P（P）*=0.6454（DMSO与SAG）。纳秒，*P（P）*> 0.05; **P（P）*< 0.01; ****P（P）*< 0.001. 误差线表示标准偏差。

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中的注释

勘误表：刺猬信号传导促进基底祖细胞扩张以及新皮质的生长和折叠。
王磊、侯思和、韩玉刚。王磊等。自然神经科学。2016年7月26日；19(8):1115. doi:10.1038/nn0816-1115b。自然神经科学。2016 PMID：27459407 没有可用的摘要。

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