跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2016年5月25日；7(5):3414-3426.
doi:10.1039/c5sc04818d。 Epub 2016年2月19日。

改进的标记开关法揭示了硫氧还蛋白作为脱二硫酶起作用并控制细胞内蛋白质过硫化水平

鲁道夫·韦德曼 1, 康斯坦丁·翁德卡 1, 盛伟伟 1, 伊斯特万·安德拉斯·斯齐亚托 2, 扬·Lj·米尔伊科维奇 1, 阿列克桑德拉·米特罗维奇 三, 迈克·兰格 1, 谢尔盖·萨维茨基 1, 普拉莫德·库马尔·雅达夫 4, 罗伯塔·托雷格罗萨 5, 埃伦·哈勒 6, 托马斯·哈勒 6, Isao Ishii先生 7, Maik Gollasch公司 2, 马克·E·伍德 8, 埃尔万·加勒登 9, 明县 10, 马修·怀特曼 11, 鲁玛·班纳吉 4, 米洛斯·菲利波维奇 12
附属公司

改进的标记开关法揭示了硫氧还蛋白作为脱二硫酶起作用并控制细胞内蛋白质过硫化水平

鲁道夫·韦德曼等。 化学科学. .

摘要

硫化氢（H2S） 已成为一种信号分子，能够调节一些重要的生理功能，如血压、神经传递和炎症。这些效应背后的机制在很大程度上仍不清楚，半胱氨酸残基的翻译后氧化修饰（蛋白质过硫化或S公司-硫水合）被认为是H的主要途径2S-诱导的生物和药理作用。作为一种信号机制，必须控制过硫化。使用改进的标记开关检测法检测过硫化物，我们在这里表明，蛋白质过硫化物水平由硫氧还蛋白系统控制。重组硫氧还蛋白对过硫化半胱氨酸的反应性几乎是对胱氨酸和易于裂解的过硫化蛋白的反应性的10倍。该反应产生H2S释放表明硫氧还蛋白可能是H的重要调节因子2过硫化物池中的S水平。硫氧还蛋白系统的抑制导致细胞内过硫化物的增加，突出硫氧还蛋白是控制H2S信号。最后，使用循环中硫氧还蛋白水平较高的HIV-1患者的血浆，我们可以证明去二硫酶的作用体内.

PubMed免责声明

数字

图1
图1。Trx与LMW过硫化物NAP-SSH反应。（A） NAP-SSH在缓冲液中进行自发重排，得到过硫化物类似物。（B） 50μM NAP-SSH衰变后MS的动力学(米/z（z）240.0347; 计算240.0359），在不存在（黑色方块）和存在50μM Trx（红色圆圈）的情况下，绘制随时间变化的曲线。（C） 时间分辨质谱米/z（z）208.0623（计算208.0638）峰，对应于NAPSH，表明Trx裂解NAP-SSH形成硫醇并释放HS–参见ESI中的图S1。（D） [Trx的反褶积质谱红色+【H】+全还原Trx（C）的（黑色）和模拟同位素分布528H（H）838N个132哦159S公司三; 绿色）。参见ESI中的图S2。（E） Trx与NAP-SSH（红色）混合的反褶积质谱和全氧化Trx（C）的模拟同位素分布528H（H）836N个132哦159S公司三; 蓝色）。参见ESI中的图S2。（F） 起始Trx光谱和用NAP-SSH孵育2分钟后获得的光谱重叠清楚地表明米/z（z）2向左移动，表示2H原子损失。
图2
图2。色氨酸系统裂解半胱氨酸和蛋白质过硫化物形成H2第（A）H条2添加不同浓度的Trx后20μM HSA-SSH的S释放(大肠杆菌)，由H进行安培测量2S敏感电极。（B） 初始利率图与。Trx浓度。（C） 结合TrxR（大鼠）和NAPDH，Trx（人）有效释放HSA-SSH中截留的所有硫，如H2S.钠2注射S作为比较的内标。（D） 通过测量NADPH氧化速率，改变HSA-SSH的浓度，并保持其他参数的浓度恒定，对反应进行动力学分析：1μM Trx（人）、0.01μM TrxR（大鼠）和250μM NADPH。实验分三次进行。（E） 用于生成CysSS的反应的示意图–/CysSSCys混合物。（F） 色氨酸动力学(大肠杆菌)用10μM CysSSCys（黑线）或CysSS氧化（1μM）–/CysSSCys混合物（红线），然后是色氨酸荧光(λ前任280 nm）变化。插图：1μM Trx与50μM CysSS反应前后的发射光谱–/CysSSCys混合物。参见ESI中的图S5。（G） CysSSCys（黑线）或CysSS反应的动力学分析–/CysSSCys与1μM Trx（人）、0.01μM TrxR（大鼠）和250μM NADPH的混合物（红线）。
图3
图3。改进的标记开关分析标记细胞裂解物和固定细胞中的过硫化物。（A） 具有绿色荧光氰乙酸衍生物、CN-BOT和氰乙酸衍生品、CN-Cy3化学结构的原始标记开关分析。（B） CSE组织提取物中蛋白质过硫化物CN-Cy3标记的验证+/+和CSE–/–老鼠(n个= 3, *对< 0.01). 蛋白质阶梯按降序排列：245、180、135、100、75、63、48、35、25和20 kDa。（C） 固定细胞中蛋白质过硫化的CN-BOT标记验证。与CBS抑制剂AOAA（2 mM）孵育1h后，SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞内的过硫化反应降低。100μM Na培养2S或2 mMd日-半胱氨酸（1h）导致蛋白质过硫化增加。半量化n个＝100个细胞使用ImageJ软件进行。数据表示平均值±S.E.M*对< 0.01.
图4
图4。过硫化与线粒体共定位。（A）细胞内过硫化的共定位研究。用融合到E1α-丙酮酸脱氢酶先导序列的RFP转染BAEC，并与线粒体靶向H孵育2S供体，AP39。（B） 用CellLight®线粒体RFP、BacMam 2.0转染SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，以观察线粒体，并用改进的标签开关法对细胞进行过硫染色。使用ImageJ（版本1.45R）进行的分析表明，显著的共同定位是明显的，使用共同定位荧光笔将其直观地表示为白色像素。线粒体靶向H2S供体AP39导致线粒体过硫化显著增加。比例尺10μm。（C） 100 nM AP39比2 mM更能诱导细胞过硫化d日-半胱氨酸。比例尺20μm。
图5
图5。H的反应2S与硫酸而非二硫化物可能是细胞内过硫化的机制。（A和B）用0.5 mM二胺孵育SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞（30分钟）不会增加细胞内过硫化，而用H孵育2哦2（100μM，30分钟）导致细胞内过硫化物含量较高（a）。100μM Na处理2S（1 h）作为阳性对照。每个实验至少记录5张图像，一式三份。（B） 使用ImageJ软件对40个细胞进行半定量。数据表示平均值±S.E.M*对< 0.01.
图6
图6。Trx系统是细胞内过硫化物水平的主要调节器。（A） 由于在自然条件下获得的细胞裂解液（HEN缓冲液，pH 7.4，1%蛋白酶抑制剂，0°C）中Trx系统的活性，改进的tag开关分析检测到的过硫化物水平随着蛋白质提取时间的延长而降低（左边的凝胶）。通过向裂解缓冲液（右侧凝胶）中添加2μM金诺芬，可以完全避免这种情况。数据表示为平均值±标准差(n个= 3), *对< 0.01. 蛋白质阶梯按降序排列：200kDa、150kDa和120KDa、100kDa，70kDa。（B） H的典型安培测量2BAEC裂解物中的S释放（1 mg/mL–1蛋白质）。首先添加细胞裂解液（第一个箭头），然后添加含有1μM Trx、0.01μM TrxR和250μM NADPH的混合物（第二个箭头）。100μM氯化锌2最后添加了，以证明响应确实来自H2S.（C–E）用2μM金诺芬抑制Trx系统1小时，导致BAE细胞内的细胞内过硫化增加，与用100μM Na处理类似2S（孵育1小时），如使用基于CN-BOT的标签切换测定法通过荧光显微镜检测的（C）或使用基于CN-Cy3的标签切换测定法在来自细胞裂解物的凝胶中测量的（D）。比例尺20μm。（E） 凝胶内荧光强度的半定量。实验分三次进行。数据表示为平均值±S.D*对< 0.01. （F–H）2μM金诺芬或100μM钠的作用2S处理（1 h，37°C）SH-SY5Y细胞内的细胞内过硫化物水平，使用基于CN-BOT的标记开关分析（F）通过荧光显微镜测量，或使用基于CN-Cy3的标记开关测试（G）通过凝胶从细胞裂解物测量。比例尺20μm。（H） 凝胶内荧光强度的半定量。实验分三次进行。数据表示为平均值±S.D*对< 0.01.
图7
图7。体外和体内硫氧还蛋白系统控制硫含量。（A） 用同位素稀释质谱法对用2μM金诺芬处理1 h的对照细胞和BAE细胞中的总硫含量进行定量（参见ESI†中的图S11）。数据以平均值±S.D.表示n个= 5, *对< 0.001. （B） 同位素稀释质谱法定量未经治疗和ART治疗的HIV患者血浆样品中的总硫含量。数据表示为平均值±S.D*对<0.001（见图S12和表S1†）。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • 用dimedone开关法检测植物中的蛋白质过硫化。
    Aroca A、Jurado-Flores A、Filipovic MR、Gotor C、Romero LC。 Aroca A等人。 方法酶制剂。2022;676:385-402. doi:10.1016/bs.mie.2022.07.024。Epub 2022年8月18日。 方法酶制剂。2022 PMID：36280359
  • 选择性过硫化物检测揭示了硫硫水合物的进化保护抗衰老作用。
    Zivanovic J、Kouroussis E、Kohl JB、Adhikari B、Bursac B、Schott-Roux S、Petrovic D、Miljkovic JL、Thomas Lopez D、Jung Y、Miler M、Mitchell S、Milosevic V、Gomes JE、Benhar M、Gonzalez Zorn B、Ivanovic Burmazovic I、Torregossa R、Mitchell JR、Whiteman M、Schwarz G、Snyder SH、Paul BD、Carroll KS、Filippovic MR。 Zivanovic J等人。 单元格元数据。2019年12月3日；30（6）：1152-1170.e13。doi:10.1016/j.cmet.2019.10.007。Epub 2019年11月14日。 单元格元数据。2019 PMID：31735592 免费PMC文章。
  • 蛋白质过硫化的测量：改进的Tag-Switch方法。
    Kouroussis E、Adhikari B、Zivanovic J、Filipovic MR。 Kouroussis E等人。 方法分子生物学。2019;2007:37-50. doi:10.1007/978-1-4939-9528-8_4。 方法分子生物学。2019 PMID：31148105 审查。
  • 一种新的过硫化物检测方法揭示了硫氧还蛋白和谷胱甘肽系统的蛋白质过硫化物和多硫化物还原功能。
    Dókaé、Pader I、BíróA、Johansson K、Cheng Q、BallagóK、Prigge JR、Pastor-Flores D、Dick TP、Schmidt EE、Arnér ES、Nagy P。 多卡埃等人。 科学进展2016年1月22日；2（1）：e1500968。doi:10.1126/sciadv.1500968。eCollection 2016年1月。 2016年科学进展。 PMID：26844296 免费PMC文章。
  • 过硫化（S-硫水合）和H2S。
    菲利波维奇先生。 菲利波维奇先生。 Handb实验药理学。2015;230:29-59. doi:10.1007/978-3-319-18144-82。 Handb实验药理学。2015 PMID：26162828 审查。
查看所有类似文章

引用人

  • 硫化物氧化促进缺氧血管生成和新生血管形成。
    Kumar R、Vitvitsky V、Sethaudom A、Singhal R、Solanki S、Alibeckoff S、Hiraki HL、Bell HN、Andren A、Baker BM、Lyssiotis CA、Shah YM、Banerjee R。 Kumar R等人。 自然化学生物。2024年3月20日。doi:10.1038/s41589-024-01583-8。打印前在线。 自然化学生物。2024 PMID：38509349
  • 心血管疾病中的硫信号通路。
    宋毅，徐忠，钟强，张锐，孙克星，陈刚。 Song Y等人。 前沿药理学。2023年11月24日；14:1303465. doi:10.3389/fphar.2023.1303465。eCollection 2023年。 前沿药理学。2023 PMID：38074127 免费PMC文章。 审查。
  • 转录因子OxyR调节谷氨酸棒杆菌.
    杜浩、齐毅、乔杰、李莉、魏莉、徐恩、邵莉、刘杰。 杜赫等。 应用环境微生物。2023年9月28日；89（9）：e0090423。doi:10.1128/aem.00904-23。Epub 2023年9月1日。 应用环境微生物。2023 PMID：37768042 免费PMC文章。
  • 细菌中活性硫物种（RSS）的传感和调节。
    Giedroc DP、Antelo GT、Fakhoury JN、Capdevilla DA。 Giedroc DP等人。 当前操作化学生物。2023年10月；76:102358. doi:10.1016/j.cbpa.2023.102358。Epub 2023年7月1日。 当前操作化学生物。2023 PMID：37399745 审查。
  • 蛋白质过硫化的新兴化学生物学。
    Vignane T，Filipovic先生。 Vignane T等人。 抗氧化氧化还原信号。2023年7月；39(1-3):19-39. doi:10.1089/ars.2023.0352。Epub 2023年7月10日。 抗氧化氧化还原信号。2023 PMID：37288744 免费PMC文章。 审查。
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Paulsen C.E.、Carroll K.S.Chem。2013年版；113:4633–4679.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 利马·B、福雷斯特·M·T、赫斯·D·T、斯坦勒·J·S·C·C·。2010年决议；106:633–646.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 赫斯·D·T、斯坦勒·J·S·J·生物学。化学。2012;287:4411–4418.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Grek C.L.、Zhang J.、Manevich Y.、Townsend D.M.、Tew K.D.J.Biol。化学。2013;288:26497–26504.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Dalle-Donne I.、Rossi R.、Colombo G.、Giustarini D.、Milzani A.Trends Biochem。科学。2009;34:85–96.-公共医学