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.2016年6月13日；8(6):720-8.
doi:10.1039/c6ib00027d。 Epub 2016年5月10日。

逐步软化水凝胶模拟肝星状细胞在纤维化消退过程中的行为

史蒂文·卡利亚里 1, 玛丽娜·佩雷佩利尤克, 伊丽莎白·M·索拉斯, 李吉云, 丽贝卡·G·威尔斯, 杰森·A·伯迪克
附属公司

逐步软化水凝胶模拟肝星状细胞在纤维化消退过程中的行为

史蒂文·卡利亚里等。 集成生物（Camb）. .

摘要

细胞外基质（ECM）为常驻细胞提供了一组不断演变的机械线索。我们开发了含有稳定和水解可降解交联物的甲基丙烯酸透明质酸（MeHA）水凝胶，为细胞提供逐渐软化（但不完全可降解）的环境，模拟纤维化消退等生理事件。为了证明这种细胞培养系统的实用性，我们研究了在这种软化环境中大鼠肝星状细胞的表型，它是纤维原性肌成纤维细胞的主要肝前体。在组织培养塑料上进行机械预处理的星形细胞获得了肌成纤维细胞表型，当接种到硬（～20 kPa）水凝胶上时，该表型持续存在。然而，刚-软（～20～～3 kPa）水凝胶上机械激发的星状细胞在14天内表现出肌成纤维细胞表型的逆转，细胞面积减少，肌成纤维标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达，以及带有PDZ结合基序的Yes相关蛋白/转录辅活化因子（YAP/TAZ）的表达与刚性水凝胶上的星状细胞相比，细胞核定位。然而，硬到软的水凝胶上的细胞并没有完全恢复。他们表现出胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达降低，并对肌成纤维细胞进行异常快速的再激活，以应对通过引入额外交联物而使水凝胶重新硬化的反应。这些特征是具有中间表型的星状细胞的典型特征，据报道在体内发生纤维化消退和再损伤。总之，这些数据表明力学在纤维化回归中起着重要作用，将动态力学线索整合到模型系统中有助于捕获体内观察到的细胞行为。

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数字

图1
图1。逐步软化水凝胶基质的制备方法
（A） 用甲基丙烯酸酯（MeHA）和RGD修饰的透明质酸（HA），通过HA上的甲基丙烯酸酯和RGD肽上的硫醇之间的迈克尔型加成。（B） 交联剂，用于RGD改性MeHA的交联，以产生稳定（DTT）或含酯类水解不稳定性（DTT，PETMA）水凝胶。（C） 通过DTT交联设计为具有相对静态机械性能的软或硬水凝胶，或通过DTT和PETMA的组合交联设计为动态软化（刚到软）水凝胶。
图2
图2。静态和动态水凝胶的表征
（A） 仅与DTT交联（软或硬）或与DTT和PETMA可降解交联剂组合（硬对软）的水凝胶配方的水凝胶弹性模量、（B）体积膨胀比和（C）HA质量损失。n个>每组每个时间点3个水凝胶。
图3
图3。肝星状细胞在硬到软的水凝胶上培养时，扩散逐渐减少
（A） 水凝胶上星状细胞培养的实验设计示意图。星形细胞最初被镀在TCPS/玻璃上，或在分离后直接镀在软静态水凝胶上。在7天的机械启动后，细胞被移动到软或硬（静态）水凝胶或硬-软水凝胶上。作为对照，将新分离的细胞接种到软水凝胶上，在没有机械启动的情况下再培养14天（总共21天）。（B） 机械启动7天期间的星形细胞相位对比图像和扩散区域。***：P（P）<0.001，玻璃组显著大于软（第7天）组。（C） 在水凝胶上电镀并再培养14天后，星形细胞相位对比图像和扩散面积。***：P（P）<0.001，刚-软组显著大于软组。比例尺：100μm。n个>每组37个细胞/时间点。
图4
图4。机械激发的肝星状细胞在硬-软水凝胶培养后失去肌动蛋白应力纤维组织
（A） 在软水凝胶或玻璃上培养7天的新鲜分离星状细胞的肌动蛋白组织的代表性图像和（B）量化。蓝色：核，绿色：α-SMA，红色：F-肌动蛋白。（C） 在软水凝胶（软静态，虚线）上培养21天的星状细胞的代表性图像和（D）肌动蛋白组织量化，或在软、硬或硬-软水凝胶上培养14天的机械激发星状细胞。蓝色：核，绿色：α-SMA，红色：F-肌动蛋白。(虚线：软静态控制）。***：P（P）< 0.001. 比例尺：100μm。n个>每组26个细胞。
图5
图5。机械激发的肝星状细胞在刚-软水凝胶上显示核YAP/TAZ减少
（A） 在软水凝胶或玻璃上培养7天的新鲜分离星状细胞的代表性图像和YAP/TAZ染色定量。蓝色：核，绿色：YAP/TAZ公司。（B） 在软水凝胶（软静态，虚线）上培养21天的星状细胞的代表性图像和YAP/TAZ染色定量，或在软、硬或硬-软水凝胶上培养14天的机械激发星状细胞。蓝色：核，绿色：YAP/TAZ公司。(虚线：软静态控制）。***：P（P）<0.001，显著高于其他实验组。比例尺：20μm。n个>每组26个细胞
图6
图6。刚-软水凝胶上星状细胞的GFAP染色显示中间表型
在软水凝胶（软静态，虚线）上培养21天的星状细胞的代表性图像和GFAP染色定量，或在软、硬或硬-软水凝胶上再培养14天的机械激发星状细胞。(虚线：软静态控制）。蓝色：核，绿色：GFAP.***：P（P）< 0.001. 比例尺：20μm。n个>每组23个细胞。
图7
图7。再硬化水凝胶导致肌成纤维细胞快速活化
（A） 水凝胶再硬化方案就地未反应水凝胶甲基丙烯酸酯的自由基聚合。（B） 光照前后刚-软水凝胶和再加固水凝胶的弹性模量。（C） 曝光前后的星形细胞扩散面积（图3再现的第14天硬到软细胞面积数据进行比较）。（D） 再强化水凝胶上星状细胞肌动蛋白组织的代表性图像和量化。蓝色：核，绿色：α-SMA，红色：F-actin（图4中再现的刚-软肌动蛋白组织数据用于比较）。（E） 再强化水凝胶上星状细胞YAP/TAZ核定位的代表性图像和量化。蓝色：核，绿色：YAP/TAZ（从图5复制的刚性到柔性的YAP/TAZ数据进行比较）。***：P（P）<0.001，显著大于刚-软组。比例尺：100μm（C，D），20μm（E）。n个>每组51个细胞。
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