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.2016年5月5日；165(4):921-35.
doi:10.1016/j.cell.2016.04.001。 Epub 2016年4月21日。

孕激素缺乏通过补体激活促进小胶质细胞的回路特异性突触修剪

汉森·路易斯 1, 张佳生 1, 斯蒂芬妮·梅金森 2, 米歇尔·卡希尔 1, 凯文·凯利 三, 黄馨仪 1, 余磊尚 1, 迈克尔·C·奥尔德姆 4, 劳伦·赫尔·马滕斯 5, 高福英 6, 乔瓦尼·科波拉 6, 史蒂文·斯隆 7, 克里斯汀·谢赫 8, 查尔斯·C·金 9, 艾琳·H·比吉奥 10, 桑德拉·温特劳布 10, Marek-Marsel Mesulam公司 10, 罗莎雷达制造商 11, 伊恩·麦肯齐 12, 威廉·西利 13, 安娜·卡里达斯 13, 布鲁斯·米勒 13, 芭芭拉·博罗尼 14, 罗伯塔·吉多尼 15, 小罗伯特·V·法雷斯 16, 珍妮·帕兹 2, 本·A·巴雷斯 7, 埃里克·J·黄 17
附属公司

孕激素缺乏通过补体激活促进小胶质细胞的回路特异性突触修剪

汉森·路易斯等。 单元格. .

摘要

小胶质细胞维持大脑内的稳态，但异常的小胶质细胞激活是否会导致神经退行性变仍存在争议。在这里，我们使用转录组分析证明额颞叶痴呆（FTD）基因progranulin（Grn）的缺失导致溶酶体和先天免疫基因的年龄依赖性、渐进性上调、补体生成增加和小胶质细胞突触修剪增强。在衰老过程中，Grn（-/-）小鼠表现出丘脑腹侧小胶质细胞的浸润和抑制性突触的优先消除，导致丘脑皮层回路的兴奋性增高和强迫症（OCD）样的梳理行为。值得注意的是，删除C1qa基因可显著减少Grn（-/-）小胶质细胞的突触修剪，并减轻Grn（-/-）小鼠的神经退化、行为表型和过早死亡。综上所述，我们的结果揭示了早先未被认识到的progranulin在抑制衰老过程中异常小胶质细胞活化方面的作用。这些结果代表了一个重要的概念进展，即补体激活和小胶质细胞介导的突触剪除是前颗粒蛋白缺乏引起的神经退行性变的主要驱动因素，而不是结果。

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数字

图1
图1。中的转录组分析Grn公司+/+,Grn公司+/−和Grn公司−/−小鼠显示小胶质细胞溶酶体和固有免疫基因的年龄依赖性上调
（A） 图中显示了描述特定大脑区域转录体特征的程序Grn公司+/+,Grn公司+/−和Grn公司−/−衰老期间的小鼠。（B） 加权相关网络分析（WGCNA）确定高度相关的基因模块，这些模块在大脑皮层中随年龄增加而上调Grn公司−/−老鼠。（C） 来自品红（大脑皮层）模块的前40个基因富含小胶质细胞基因（插图），它们的表达模式之间存在广泛的地形重叠，尤其是补体C1qa公司,C1qb（十亿加元）,C1质量控制和C3类,抄送68和特雷2.（D）显示从4个月龄和16个月龄婴儿分离小胶质细胞的程序的图表Grn公司+/+和Grn公司−/−小鼠使用不连续等渗Percoll梯度、FACS、扩增反义RNA（aaRNA）的制备、微阵列和生物信息学分析。（E） 16个月大的分离细胞Grn公司+/+和Grn公司−/−用CD11b PE[克隆M1/70]（Invitrogen）、CD45 APC[克隆Ly5]（eBioscience）和抗Ly6G PE-Cy7[克隆1A8]（BD Biosciencies）培养小鼠，并用Beckman-Coulter MoFlo XDPs流式细胞仪进行分类。（F） 小胶质细胞被定义为CD45洛;CD11b型+，而巨噬细胞被定义为CD45你好;CD11b型+FACS中的人口。数据显示为总事件的%。学生的t吨测试，n=3Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。**表示对<0.01，ns，不显著。（G） 4个月龄和16个月龄FACS分类小胶质细胞500个最大可变转录物的主成分分析Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。（H） 4个月龄和16个月龄FACS分类小胶质细胞前200个转录物的层次聚类分析Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。参见图S1和表S1。
图2
图2。溶酶体缺陷和补体生成增加Grn公司−/−小胶质细胞
（A）–D） 4月龄和18月龄儿童丘脑腹侧Iba-1+小胶质细胞的共焦图像Grn公司+/+和Grn公司−/−大脑显示细胞质中有CD68+溶酶体。图像是从捕获的Grn公司+/+和Grn公司−/−大脑（每个年龄3个），并使用Imaris软件进行溶酶体三维重建。（E） 4月龄和18月龄儿童丘脑腹侧CD68+溶酶体体积的定量Grn公司+/+和Grn公司−/−4个月大的小鼠大脑（左侧面板）Grn公司+/+和Grn公司−/−MPTP治疗后的小鼠大脑（右侧面板）。体积表示为μm三每个小胶质细胞。学生的t吨测试，每组n=3。*表示对< 0.05, **对<0.01，以及****对< 0.001. （F）–一） 新生儿原发性小胶质细胞培养的共焦图像Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠的大脑。小胶质细胞标记有Lamp1/PGRN/Rab7或Lamp1/PGRN/Sortilin抗体。箭头表示每个小胶质细胞中的区域，其中荧光信号强度图是使用尼康NIS-Elements获得的。Lamp1+（绿色）、PGRN+（红色）、Rab7+（蓝色）和Sortilin+（蓝色Grn公司+/+和Grn公司−/−小胶质细胞。F′和H′中的箭头表示Lamp1+的部分重叠；PGRN+或PGRN+；分别发出分拣+信号。（J）–K） Lamp1+、Sortilin+和Rab7+囊泡大小的量化Grn公司+/+和Grn公司−/−小胶质细胞。学生的t吨测试，****表示对< 0.001. （五十） 图中显示了培养小胶质细胞中的DQ-BSA分析。开环为淬灭DQ-BSA，绿色环为去淬DQ-BSA，红色环为BSA与568nm荧光团共轭。（百万）–P） 的代表性图像Grn公司+/+和Grn公司−/−小胶质细胞用DQ-BSA孵育30′后（0小时）或洗涤4小时后（4小时）。P中的比例尺为10μm。每个面板右侧的插图表示M-P中方框区域的放大图像。P中的箭头表示Lamp1+溶酶体中的去猝灭DQ-BSA信号。（Q） 去猝灭DQ-BSA最大荧光强度（M.F.I.）的量化Grn公司+/+（n=5）和Grn公司−/−小胶质细胞（n=7）。巴非霉素抑制溶酶体酸化和蛋白质降解Grn公司+/+和Grn公司−/−小胶质细胞。双向方差分析，*表示对< 0.05. 另请参见图S2。
图3
图3。突触修剪活动增加Grn公司−/−小胶质细胞需要C1qa
（AC）显示小胶质细胞-神经元共同培养的图表和Sholl分析，以量化小胶质细胞周围的突触。（D）–S） 共焦图像显示周围存在突触（SPH+）Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−小胶质细胞（Iba1+）（D，H，L，P）。低倍镜下小胶质细胞-神经元共培养的Imaris 3D图像重建（E，I，M，Q）。高倍镜显示小胶质细胞（G，K，O，S）CD68+溶酶体内存在C1qa紧邻突触（F，J，N，R）和C1qa标记突触。D中标尺20μm，E中标尺5μm，F和G中标尺1μm。（T）周围突触密度Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−小胶质细胞***对< 0.005, ****对<0.001，双向方差分析，所有基因型n=4。（U–五） 量化小胶质细胞外C1qa标记突触的百分比（U）和小胶质细胞内SPH+突触的数量（V）*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.005，学生的t吨检验，每个基因型n=4。另请参见图S3。
图4
图4。年龄依赖性C1qa在丘脑腹侧突触的积累Grn公司−/−小鼠
（A）–B） QRT-PCR检测C1qa公司和C3类12个月大的大脑皮层（CTX）、海马（HIP）、尾壳核（CP）、小脑（CRB）和丘脑（THAL）中的mRNAGrn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。（C）–D） QRT-PCR显示C1qa公司和C3类4月龄、9月龄、12月龄和18月龄丘脑mRNA的表达Grn公司−/−老鼠。（E）–F） 蛋白质印迹显示4、9和18个月大的丘脑中C1qa和C3蛋白的相对丰度Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.005，学生的t吨测试。误差条表示s.e.m.n=每年龄3Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。（G–J） 4个月龄和18个月龄儿童的免疫染色Grn公司+/+和Grn公司−/−小鼠大脑检测VPM和VPL丘脑核团（虚线区域）中的C1qa信号。G中的比例尺为500μm。（K）–P） 使用神经标记物TuJ1和C1qa抗体对12个月大的腹侧丘脑进行共聚焦成像Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。P中的比例尺为10μm。（问）–五） 12个月大婴儿腹侧丘脑突触素和C1qa的聚集Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。V中的比例尺为10μm。（W–十） 免疫金EM检测12个月大婴儿腹侧丘脑突触中的C1qa沉积Grn公司+/+和Grn公司−/−老鼠。比例尺为0.5μm。（Y） 使用4、9和16个月大的突触体的蛋白质印迹Grn公司+/+和Grn公司−/−大脑检测C1qa和裂解的C3蛋白。
图5
图5。丘脑腹侧小胶质细胞数量减少和突触密度保持Grn公司−/−;C1qa公司−/−突变小鼠
12个月大婴儿冠状切片中Iba-1的（A-H）免疫染色Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−小鼠大脑位于海马前部水平。面板A、C、E和G中的方形虚线框突出显示了腹侧丘脑，在这里可以获得更高的放大率图像。A区标尺500μm，B区标尺50μm（I）Iba-1+丘脑腹侧小胶质细胞密度Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−2、4、7、12和19个月龄的小鼠大脑***对< 0.005, ****对<0.001，双向方差分析，n=4每基因型/年龄。（J）–M） 12个月大婴儿突触素的共焦图像Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−大脑。J（N）突触体素密度为10μm的比例尺Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−2个月、4个月、7个月、12个月和19个月大时的大脑*对< 0.05, **对< 0.01, ***对<0.005，ns，不显著。学生的t吨经检验，n=4每基因型每年龄。
图6
图6。在中卸下C1qaGrn公司−/−;C1qa公司−/−小鼠保护突触修剪，恢复丘脑微电路功能，减轻OCD样行为，提高生存率
（A–D）小白蛋白（Parv）的共焦图像显示，12个月大的婴儿的网状核（TRN）中的Parv+神经元向腹后内侧核（VPM）和腹后外侧核（VPL）的投射Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−老鼠。虚线突出显示VPM和VPL核，并在A′-D′中放大倍数较高的正方形区域。D中的比例尺为500μm，D′中为20μm。（E）–H） 19个月大婴儿丘脑腹侧VGAT+突触的共焦图像Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−老鼠。H中的比例尺为25μm。（I）8个月、12个月和19个月大的丘脑腹侧VGAT+突触密度的量化Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−老鼠。学生的t吨测试，*表示对< 0.05, **对<0.01和ns，无统计学意义。（J） 丘脑切片图像显示内囊中的刺激电极和记录VPM和VPL中多单位放电的16通道线性阵列硅探针。（K） 典型的丘脑腹侧多单位记录（J中的橙色方框）Grn公司+/+,Grn公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−老鼠。黑色圆圈表示刺激伪影。底部的速率计显示相对于时间（Y轴）的刺激扫描（X轴）的一致诱发峰值速率。（五十） 人口数据的准刺激时间直方图Grn公司+/+, 7Grn公司−/−和4Grn公司−/−;C1qa公司−/−老鼠。插图底部：（L）中黑色虚线框的放大显示反应斜率在基因型之间存在显著差异（***，对<0.0001，F=10.5554）。插图顶部：触发AP发射频率的相对概率图Grn公司+/+,Grn公司−/−、和Grn公司−/−;C1qa公司−/−Kolmogorav-Smirnov试验分析的小鼠(Grn公司+/+与。Grn公司−/−, ***对<0.0001，D=0.5783；Grn公司+/+与。Grn公司−/−;C1qa公司−/−, ***对<0.0001，D=0.4980；Grn公司−/−与。Grn公司−/−;C1qa公司−/−,***对<0.0001，D=0.7751）。错误栏、s.e.m.、（m）中的整理活动Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−小鼠表示为总时间的百分比*对< 0.05, **对<0.01，ns，不显著，学生t吨测试。（N–O）Kaplan-Meier曲线用于皮肤损伤发病和存活Grn公司+/+,Grn公司−/−,C1qa公司−/−和Grn公司−/−;C1qa公司−/−老鼠*对< 0.05, ****对<0.001，ns，不显著，Long-rank（Mantel-Cox）测试。另请参见图S4、S5和S6以及补充电影S1。
图7
图7。FTLD中的小胶质细胞病理和脑脊液补体水平Grn公司突变携带者
（A–H）对照组额叶皮质的免疫染色，FTLDGrn公司携带者和AD患者检测到小胶质细胞和C1qa（A–B，D–E，G–H）的存在。此外，免疫金EM检测到FTLD中突触处存在C1qa沉积Grn公司突变携带者（C，F）。A、B、D、E、G和H中的箭头表示小胶质细胞。箭头在G中表示淀粉样斑块，在H中表示血管（BV）。C和F的箭头表示突触前终末，F的箭头则表示突触中的C1qa阳性免疫金颗粒。（I） 对照组（n=7）额叶皮质中Iba-1+小胶质细胞的定量，FTLDGrn公司携带者（n=16）和AD患者（n=8）***对< 0.005, ****对<0.001，ns，不显著，学生t吨测试。（J） 对照组和FTLD中CSF PGRN水平的量化GRN公司载体。学生的t吨测试，****表示对< 0.0001. （K–L）ELISA检测对照组（n=23）和FTLD脑脊液中C1qa和C3b蛋白水平Grn公司载波（n=19）。计算拟合优度的X平方检验R（右）2和对值。另请参见图S7、表S2和表S3。
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