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.2016年6月；17(6):712-20.
doi:10.1038/ni.3439。 Epub 2016年4月25日。

葡萄糖和谷氨酰胺燃料蛋白O-GlcNA酰化控制T细胞自我更新和恶性肿瘤

马希玛·斯瓦米 1, 沙利尼·帕塔克 1, Katarzyna M Grzes公司 1, 塞巴斯蒂安·达梅罗 2, 琳达·V·辛克莱 1, Daan M F van Aalten公司 三, 多琳A餐厅 1
附属公司

葡萄糖和谷氨酰胺燃料蛋白O-GlcNA酰化控制T细胞自我更新和恶性肿瘤

马希玛·斯瓦米等。 自然免疫. 2016年6月.

摘要

持续的葡萄糖和谷氨酰胺转运对于活化的T淋巴细胞支持ATP和大分子生物合成至关重要。我们发现，谷氨酰胺和葡萄糖在T细胞发育、转化和分化的关键阶段对细胞内蛋白O-GlcNAcylization也起着不可或缺的动态调节作用。葡萄糖和谷氨酰胺是尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）的前体，是细胞糖基转移酶的底物。与原始细胞相比，免疫激活T细胞含有更高浓度的UDP-GlcNAc，并且由O-连接-β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）糖基转移酶控制的细胞内蛋白O-GlcNA酰化增加。我们确定Notch、T细胞抗原受体和c-Myc是通过调节葡萄糖和谷氨酰胺转运实现T细胞蛋白O-GlcNA酰化的关键控制器。O-GlcNAc转移酶的缺失阻碍了T细胞祖细胞的更新、恶性转化和外周T细胞克隆的扩增。因此，O-GlcNAc糖基转移酶调节的营养依赖性信号通路是T细胞生物学的基础。

PubMed免责声明

利益冲突声明

声明作者没有相互竞争的利益，也没有其他可能影响本文报告的结果和讨论的利益。

数字

图1
图1
T细胞通过关键的营养敏感途径利用葡萄糖和谷氨酰胺摄入来合成UDP-GlcNAc。(一)吸纳三H-2-脱氧葡萄糖或三H-谷氨酰胺通过维持在IL-7（IL-7）（n=2只小鼠）或用CD3/CD28抗体刺激的TCR中的幼稚淋巴结（LN）T细胞作用24小时（n=3只鼠）。(b条)吸纳三H-2-脱氧葡萄糖或三效应剂CD8产生的H-谷氨酰胺+T细胞（CTL）或CD4+辅助T细胞（TH（H）1） 或幼稚T细胞在IL-7中维持24小时（IL-7）。(c（c）)葡萄糖和谷氨酰胺摄入进入己糖胺生物合成途径，产生UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-GlcNAc），这是OGT的底物。氨基葡萄糖绕过了合成氨基葡萄糖-6-磷酸的速率限制步骤，以及生成UDP-GlcNAc所需的葡萄糖和谷氨酰胺。(d-g型)通过LC-MS/MS测量的UDP-GlcNAc浓度（每个n=3只小鼠）。(d日)原始（0小时）CD8中的UDP-GlcNAc+T细胞，CD3/CD28刺激CD8+T细胞（24小时）和CTL。(e（电子）)幼稚（0小时）CD4中的UDP-GlcNAc+T细胞，CD3/CD28刺激的CD4+T细胞（24小时）和TH（H）1个效应器。(（f）)OT-I T细胞中的UDP-GlcNAc浓度未经刺激（维持在IL-7、IL-7中）或用肽在完全培养基或缺乏葡萄糖（-Glc）或谷氨酰胺（-Gln）的培养基中激活24小时。(克)在补充如指示的培养基中刺激的OT-I细胞中的UDP-GlcNAc浓度*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（单因素方差分析，n=3只小鼠）。数据来自一个代表3人的实验(a、，生物复制的平均值和s.e.m.），4(b条，技术复制的平均值和s.e.m.，n=1），每个实验一次(d-g型).
图2
图2
TCR激活上调T细胞中的O-GlcNA酰化。(一)幼稚（–）和24小时CD3/CD28活化（+）T细胞（n=2只小鼠）中O-GlcNAc的免疫印迹分析。(b条)未经处理（1、3、4通道）或经CpOGA处理（2通道）的CTL裂解产物的免疫印迹。用O-GlcNAc抗体进行免疫印迹（1、2道），或用0.5 M N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）预先培养抗体（3、4道）。(c（c）)使用CTL和初始CD8的O-GlcNAc抗体（RL2）进行细胞内流式细胞术分析+T细胞。(d日)原始CD8的流式细胞术分析+含有O-GlcNAc抗体的T细胞，该抗体与游离N-乙酰氨基葡萄糖（+GlcNAc）预先孵育或未孵育。(e（电子）)经CpOGA处理的CTL的O-GlcNAc流式细胞术分析。(（f）)显示CTL（灰色）和T细胞前向散射（FSC）和O-GlcNAc强度的点图H（H）1（黑色）培养物（n=1只小鼠）。皮尔逊相关系数=-0.072（CTL），0.036（TH（H）1） 。(克)对6小时活化的OT-I T细胞进行固定、渗透和分析，或对活细胞进行O-GlcNAc流式细胞术分析。(小时)用CD3/CD28抗体刺激幼稚LN T细胞（n=3只小鼠）6、24或48小时，将其O-GlcNAc平均荧光强度（MFI）归一化为幼稚静止T细胞的分数差（CD62L门控你好，第44页洛). (我)O-GlcNAc流式细胞术数据标准化为OT-I CD8的（h）+用OVA衍生肽刺激T细胞24小时。总CD8的O-GlcNAc MFI+将T细胞归一化为未激活细胞的MFI（n=4只小鼠，来自2个实验）。(j个)OT-I T细胞的O-GlcNAc MFI（标准化为幼稚细胞）用Q4肽的系列稀释液刺激6小时（n=3只小鼠）。(k-l公司)CD69的O-GlcNAc流式细胞术分析+或CD69–脾CD4+(k个)和CD8+(我)从静脉感染的小鼠（n=5）分离的T细胞李斯特菌。(米)用OGA抑制剂（OGAi）或OGT抑制剂（OGTi）处理CTL中规定时间的归一化（至未处理）O-GlcNAc MFI*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01***P（P）< 0.001 (小时，单向方差分析，与0小时时间点相比，k、 我，配对t检验）。数据是2个类似实验的代表(一)1个实验(b条)，3个实验(h、 i、j、，平均值±显示的标准差），实验显示c-g公司代表至少5个实验(米)左，所示2个实验的n=5个培养物的平均值（±s.d.），右，n=1，代表2个实验。
图3
图3
葡萄糖和谷氨酰胺的摄取在胸腺细胞β-选择和O-GlcNAcylization中受到调节。(一)吸纳三H-2-脱氧葡萄糖和1410只野生型小鼠胸腺细胞中的C-谷氨酰胺分为DN3、DN4和DP亚群。(b条)对O-GlcNAc和TCRβ以及不同亚群（n=6只小鼠）的表面标记物进行细胞内流式细胞术分析。(c（c）)DN3-4胸腺细胞在有IL-7（5 ng/ml）存在的OP9或OP9-DL1上培养2天。吸纳三H-2-脱氧葡萄糖和14测定C-谷氨酰胺，以及(d日)任一总Thy1中的细胞内O-GlcNAc水平+OP9或OP9-DL1上的电池，或(e（电子）)OP9-DL1上生长的细胞和DP（CD4）上的门控细胞+CD8（CD8）+)和DN（CD4-CD8（CD8）-)胸腺细胞***P（P）<0.001（单向方差分析）。数据来自1个实验(一)，2个混合实验和5个类似实验的代表(b条)，1个实验代表3个独立实验(c、 天).
图4
图4
在T细胞发育的DN阶段OGT的丢失导致T细胞发育严重受阻。(一)从胸腺分离的细胞总数奥格特重量/重量Lck公司-Cre公司+小鼠（n=21）和奥格特fl/Y或fl/flLck公司-Cre公司+绘制小鼠（n=21）。(b条)Thy1上CD4和CD8表达的代表性流式细胞术+胸腺细胞来自奥格特重量Lck公司-Cre公司+和奥格特液体/液体Lck公司-Cre公司+来自的老鼠(一). (c（c）)6-12周龄婴儿胸腺亚群的量化奥格特重量/重量Lck公司-Cre公司+（n=9）和奥格特fl/Y或fl/flLck公司-Cre公司+小鼠（n=9）。(d日)流式细胞仪直方图显示细胞内O-GlcNAc水平奥格特重量/重量Lck公司-Cre公司+（重量）和奥格特液体/液体Lck公司-克里+（KO）DN4和DP子集。(e（电子）)细胞内流式细胞术检测DN3和DN4亚群中TCRβ（前TCR）奥格特重量/重量Lck公司-Cre公司+和奥格特液体/液体Lck公司-Cre公司+胸腺。(f-i型)OGT公司重量/重量Lck-Cre公司+和奥格特液体/液体Lck公司-Cre公司+DN胸腺细胞在有或无5 ng/ml IL-7的OP9或OP9-DL1饲养细胞上培养6天。OP9-DL1培养后3天(（f）)或OP9(克),奥格特重量/重量Lck公司-Cre公司+和奥格特液体/液体Lck公司-Cre公司+对胸腺细胞进行CD4和CD8染色。(h、 我)扩散奥格特重量/重量Lck公司-Cre公司+和奥格特液体/液体Lck公司-Cre公司+在OP9-DL1喂料器上培养的DN胸腺细胞(小时)或OP9(我)在5 ng/ml IL-7的存在下。NS，不显著(P（P）=0.251), ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001（未配对t检验(一)，Mann-Whitney秩和检验(c（c）)). 数据是累积的(a、 c)或代表40只以上的小鼠(b条)，3只小鼠(d日)，3只小鼠(e（电子）)和(f-i型)是3个独立实验的代表。
图5
图5
OGT缺失可阻止PTEN阴性胸腺细胞的转化。分析(一)三H-2-脱氧葡萄糖摄取和(b条)三胸腺分离细胞对H-谷氨酰胺的摄取铂族飞行/飞行Lck公司-Cre公司–和胸腺瘤铂族飞行/飞行Lck公司-克里+小鼠（n=1）。(c（c）)两个代表性胸腺淋巴瘤细胞中相同数量的O-GlcNAcylation和OGT的免疫印迹分析铂族飞行/飞行Lck公司-Cre公司+小鼠和两种小鼠的胸腺细胞总数铂族飞行/飞行Lck公司-Cre公司–老鼠。采用SMC1作为加载控制。(d日)Kaplan-Meier生存图比较铂族飞行/飞行Lck公司-Cre公司+（n=8）只小鼠与铂族飞行/飞行奥格特fl/fl或fl/YLck公司-Cre公司+（n=10）只小鼠。(e（电子）)老年人胸腺细胞平均数铂族飞行/飞行奥格特fl/fl或fl/YLck公司-Cre公司+小鼠（n=8，平均年龄=239天），与相似年龄的野生型（WT）小鼠（n=3）相比。(（f）)Thy1中CD4和CD8表达的代表性流式细胞术图+胸腺细胞来源于铂族液体/重量奥格特重量Lck公司-Cre公司+和铂族飞行/飞行奥格特液体/液体Lck公司-Cre公司+6周龄胸腺***P（P）= 0.000228, ****P（P）<0.0001（对数秩（Mantel-Cox）检验(d日)，未配对t检验(e（电子）)). 数据来自一个实验，代表3(a-c公司)，累计(d、 电子)和代表性的3只小鼠(（f）).
图6
图6
在T细胞发育的DP阶段，OGT的缺失会阻碍正向选择。(一)静止DPs（TCRβ）的O-GlcNAc流式细胞术分析洛CD69型−)，预选（TCRβ洛CD69型你好)，后选（TCRβ你好CD69型你好)胸腺细胞、成熟CD4SP和CD8SP（TCRβ你好CD69型洛CD24型洛). 如补充图2a所示，对人群进行电子门控。(b条)6-12周龄婴儿胸腺亚群细胞数量的量化奥格特重量/重量抄送4-Cre公司+（n=4）和奥格特飞行/飞行抄送4-Cre公司+小鼠（n=4）。(c（c）)Thy1上CD4和CD8表达的代表性流式细胞术图+胸腺细胞来自奥格特重量/重量抄送4-克里+和奥格特液体/液体抄送4-Cre公司+老鼠。(d日)TCRβ总数+从中分离的细胞奥格特重量/重量抄送4-Cre公司+脾（n=9）和奥格特飞行/飞行抄送4-Cre公司+绘制脾脏（n＝9）。(e（电子）)3株胸腺细胞OGT和负荷控制SMC1的免疫印迹分析奥格特重量/重量抄送4-Cre公司+和3奥格特液体/液体抄送4-Cre公司+老鼠。(（f）)WT和KO胸腺细胞TCRβ表达和CD69表达的代表性流式细胞术（Thy1门控+活细胞）。右侧TCRβ表达直方图如所示奥格特重量/重量抄送4-Cre公司+（n=1）和奥格特液体/液体抄送4-Cre公司+（n＝3）胸腺细胞。NS，不显著**P（P）=0.00437, ***P（P）< 0.001, ****P（P）<0.0001（单向方差分析(一)，t-测试(b、，平均值±s.e.m），Mann-Whitney秩和检验(d日)). 数据是累积的(a、 b、d)，代表9只小鼠(c、 （f）)，和一个实验(e（电子）).
图7
图7
蛋白O-GlcNAcylation调节c-Myc表达和T细胞克隆扩增。(a、 b条)脾T细胞原代CTL培养每天获得的细胞总数奥格特重量Tamox-Core公司+或奥格特液体/液体Tamox-Core公司+老鼠。在(一)在清洗和激活之前，用4-OHT处理幼稚脾细胞4小时。在(b条)第5天进行4-OHT治疗。(c（c）)培养为(b条)按指示进行免疫印迹。(d日)GFP-Myc公司KI公司在OGA或OGT抑制剂（OGAi，OGTi）存在的情况下，用CD3/CD28抗体刺激LN T细胞（n=5只小鼠）6小时。绘制了归一化为原始T细胞的GFP-myc MFI。(e（电子）)用c-Myc免疫印迹法分析OT-I CTL裂解产物中的sWGA亲和纯化（AP）。在对c-Myc和OGT进行亲和纯化和免疫印迹之前，细胞裂解液要么未经处理，要么用CpOGA处理。检测总蛋白O-GlcNA酰化和c-Myc的总裂解产物。(（f）)从GFP-Myc进行GFP免疫纯化（IP）KI公司未经处理或经CpOGA处理的CTL裂解物。用RL2抗体检测免疫纯化的GFP-Myc。对裂解产物进行总蛋白O-GlcNAcylation和c-Myc的免疫印迹*P（P）= 0.017, **P（P）<0.001（单向方差分析）。数据来自每个实验(a、 b条，平均值±s.d.n=3只小鼠（每个基因型）(一)和5(b条)实验，数据来自两个混合实验(d日)和中的数据(c、 e、f)来自一个实验，代表2个(c（c）), 2 (e（电子）)和4(（f）)实验。
图8
图8
c-Myc通过葡萄糖和谷氨酰胺流量调节蛋白质O-GlcNA酰化。(一)在含有不同剂量葡萄糖或谷氨酰胺的RPMI中培养20小时的第7天CTL（n=6只小鼠）的O-GlcNAc流式细胞术分析。O-GlcNAc MFI归一化为在最高浓度葡萄糖或谷氨酰胺中生长的CTL的MFI。(b条)在含有不同剂量葡萄糖或谷氨酰胺的RPMI培养基中培养6小时激活OT-I T细胞（n=3只小鼠）的O-GlcNAc流式细胞术分析，按(一). (c（c）)总活CD8的O-GlcNAc流式细胞术分析+来自LN的T细胞Myc公司飞行/飞行抄送4-Cre公司–（n=3）和Myc公司飞行/飞行抄送4-Cre公司+（n=3）只小鼠，用CD3/CD28抗体刺激18小时（+），或在隔离后直接固定（-）。(d-g型)GFP-myc公司KI公司LN T细胞（n=6只小鼠）在完全培养基中，或在补充或不补充葡萄糖胺（+GlcN）的缺葡萄糖（-Glc）培养基中激活6–24小时，或在添加或不添加葡萄糖胺（-GlcN）的缺乏谷氨酰胺（-Gln）的培养基中活化6–24个小时。(d日)6小时后通过细胞内流式细胞术测量O-GlcNAc MFI，并将其归一化（n=6）为未刺激细胞。(e（电子）)6小时后测量GFP-myc荧光强度，并将其归一化为未刺激细胞。(（f）)6小时后测量CD69 MFI，以及(克)24小时后测量的CD71 MFI（n=3只小鼠）归一化为全培养基中刺激的细胞。NS，不显著*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001（单向方差分析）。数据来自两个实验(a、，n=6（葡萄糖）n=5（谷氨酰胺）的平均值±s.e.m(一)或者一个实验(b、，n=3的平均值±标准差），一个实验(c（c）)或从两个实验中合并(d-g，平均值±标准差）。
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中的注释

  • 蛋白质糖基化激活T细胞。
    Yang WH，Marth JD。 Yang WH等。 自然免疫学。2016年5月19日；17(6):613-4. doi:10.1038/ni.3468。 自然免疫学。2016 PMID：27196512 没有可用的摘要。

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