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.2016年5月19日；533(7603):420-4.
doi:10.1038/nature17946。 Epub 2016年4月20日。

无需双链DNA切割的基因组DNA目标碱基的可编程编辑

亚历克西斯·C·科莫 1 2, Yongjoo B Kim先生 1 2, 迈克尔·S·帕克 1 2, 约翰·苏利斯 1 2, 大卫·R·刘 1 2
附属公司

无需双链DNA切割的基因组DNA目标碱基的可编程编辑

亚历克西斯·C·科莫等。 性质. .

摘要

当前的基因组编辑技术在目标位点引入双链DNA断裂，作为基因校正的第一步。虽然大多数遗传病都是由点突变引起的，但目前的点突变校正方法效率低下，并且通常会导致细胞对dsDNA断裂的反应在目标位点产生大量的随机插入和删除（indels）。这里我们报告了“碱基编辑”的发展，这是一种新的基因组编辑方法，可以以可编程的方式将一个目标DNA碱基直接、不可逆地转换为另一个，而不需要dsDNA主干裂解或供体模板。我们构建了CRISPR/Cas9和胞苷脱氨酶的融合物，该融合物保留了用引导RNA编程的能力，不会诱导dsDNA断裂，并介导胞苷直接转化为尿苷，从而实现C→T（或G→a）取代。由此产生的“碱基编辑器”在大约五个核苷酸的窗口内转换胞苷，并可以有效地纠正与人类疾病相关的各种点突变。在四个转化的人类和小鼠细胞系中，融合尿嘧啶糖基化酶抑制剂并使用针对未编辑链的Cas9缺口酶的第二代和第三代碱基编辑程序操纵细胞DNA修复反应，以促进期望的碱基编辑结果，以最少（通常≤1%）的吲哚生成量永久校正约15-75%的细胞总DNA。基础编辑扩大了点突变基因组编辑的范围和效率。

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数字

扩展数据图1
扩展数据图1。脱氨酶、连接子长度和连接子组成对碱基编辑的影响
一，凝胶脱氨酶分析显示rAPOBEC1、pmCDA1、hAID、hAPOBEC3G、rAPOBEC 1-GGS-dCas9、rAPOBEC1-（GGS）的活性三-dCas9和dCas9-（集气站）三-ssDNA上的rAPOBEC1。酶在哺乳动物细胞裂解物中表达在体外转录-翻译系统，与1.8μM染料结合的ssDNA和USER酶（尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶VIII）在37°C下孵育2小时。所得DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶上分解并成像。阳性对照是一个序列，在与目标C相同的位置合成了一个U。b条，在（c）、（d）、（e）和（f）中使用的表达和纯化的蛋白质的考马斯染色变性PAGE。立方英尺，凝胶脱氨酶分析显示具有脱氨酶的碱基编辑器的脱氨酶窗口–GGS（c），（GGS）的Cas9连接子三（d） 、XTEN（e）或（GGS）7（f） 。将1.85μM脱氨酶-dCas9融合物与sgRNA和125 nM dsDNA底物在37°C孵育2小时后，分离出染料结合DNA，并在37°C与USER酶孵育1小时，以劈开任何Us位点的DNA主干。所得DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并对染料结合链进行了成像。每条车道都根据目标C在原间隔棒内的位置进行编号，如果没有目标C，则使用–进行编号。8U是一个正控制序列，在位置8处合成了一个U。凝胶源数据见补充图1。
扩展数据图2
扩展数据图2。BE1能够纠正与疾病相关的突变在体外
a、，七种疾病相关突变的原间隔区和PAM序列（红色）。每个病例中与疾病相关的靶点C用下标数字表示，反映其在原间隔区内的位置。对于所有突变，除了两者载脂蛋白4SNP，目标C驻留在模板（非编码）链中。b、，脱氨酶分析显示每个dsDNA 80-mer寡核苷酸在（-）和（+）与BE1孵育、DNA分离以及与USER酶孵育以在含有U的位置切割DNA之前和之后。在原间隔区内不同位置含有U的合成寡核苷酸与USER酶孵育的阳性对照区显示了相应的数字，表示U的位置。编辑效率的量化方法是将每个样本的劈开产品带的强度除以整个通道的强度。凝胶源数据见补充图1。
扩展数据图3
扩展数据图3。BE1的加工性
顶部显示了含有八个连续Cs的60个DNA寡核苷酸的原间隔区和PAM（红色）。将寡核苷酸（125 nM）与BE1（2μM）在37°C下孵育2 h。分离DNA并通过高通量测序进行分析。所示为观察到的最频繁的九个序列的总读取百分比。绝大多数编辑过的股（>93%）有一个以上的C转换为T。
扩展数据图4
扩展数据图4。哺乳动物细胞中BE1碱基编辑效率显著降低
a、，碱基编辑器针对的六个哺乳动物细胞基因组位点的原间隔区（黑色和红色）和PAM（蓝色）序列。目标C用红色表示，下标数字与它们在原间隔物中的位置相对应。b、，合成的80个单体与六个不同的基因组位点相匹配，与BE1孵育，然后通过HTS进行碱基编辑分析。对于每个站点，原间隔序列显示在站点名称的右侧，PAM以蓝色突出显示。每个序列下面是总DNA测序读数与相应碱基的百分比。我们认为目标C是“可编辑的”，如果在体外转化效率>10%。注意，最大产量是总DNA测序读数的50%，因为非靶链不受BE1的影响。数值来自单个实验。c、，用表达BE1的质粒和适当的sgRNA转染HEK293T细胞。转染后三天，提取基因组DNA，并通过HTS在六个位点进行分析。BE1在所有六个基因组位点上的细胞C到T转换百分比，定义为在所示的目标位置上用T进行总DNA测序读取的百分比。HEK293T细胞所有数据的值和误差条反映了在不同日期进行的三个独立生物复制的平均值和标准偏差。
扩展数据图5
扩展数据图5。BE2在U2OS和HEK293T细胞中的基本编辑效率
显示了HEK293T细胞和U2OS细胞中六个靶向基因组位点中每个位点BE2的细胞C到T转换百分比。使用脂质体2000转染HEK293T细胞，并对U2OS细胞进行核感染。质粒传递后3天，提取基因组DNA并通过HTS对6个基因组位点进行碱基编辑分析。数值和误差条反映了在不同日期进行的至少两次生物实验的平均值和标准差。
扩展数据图6
扩展数据图6。基础编辑在多个单元格分区上持续存在
HEK293T细胞传代前后HEK293位点3和4的BE2和BE3细胞C到T转换百分比显示。用表达BE2或BE3的质粒和靶向HEK293位点3或4的sgRNA对HEK293T细胞进行核感染。细胞核感染三天后，细胞被收获并分裂成两半。其中一半接受高温超导分析，另一半被允许繁殖大约五个细胞分裂，然后收获并接受高温超导研究。数值和误差线反映了至少两个生物实验的平均值和标准偏差。
扩展数据图7
扩展数据图7。非目标C/G突变率
这里显示的是在所测试的6个靶向和34个非靶向基因座周围2500个不同的胞嘧啶和鸟嘌呤的C到T和G到A突变率，代表从大约1.8×106细胞。a、，通过BE1、BE2和BE3的细胞非靶标C到T和G到A的转化百分比分别相对于所有2500个胞嘧啶/鸟嘌呤相对于原间隔区的位置绘制。PAM远端的原间隔区一侧用正数表示，而包括PAM的一侧用负数表示。b、，显示了BE1、BE2和BE3的平均非目标细胞C到T和G到A转换百分比，以及最高和最低的单个转换百分比。
扩展数据图8
扩展数据图8。BE3介导的哺乳动物细胞两种疾病相关突变校正的附加数据集
对于每个位点，原间隔区的序列显示在突变名称的右侧，PAM用蓝色突出显示，负责突变的碱基用红色粗体表示，下标数字与它在原间隔区内的位置相对应。显示了每个疾病相关等位基因上方的氨基酸序列，以及经过绿色碱基编辑的校正氨基酸序列。每个序列下面是总测序读数与相应基数的百分比。用编码BE3的质粒和适当的sgRNA对细胞进行核感染。核感染后两天，从受核感染的细胞中提取基因组DNA，并通过HTS进行分析，以评估致病突变的校正。a、，阿尔茨海默病相关载脂蛋白4等位基因被转换为APOE3r公司仅当用正确的sgRNA处理时，BE3在小鼠星形胶质细胞中的读取量占总读取量的58.3%。附近的两个Cs也转换为Ts，但结果蛋白的预测序列没有改变。用wt Cas9和供体ssDNA对这些细胞进行相同的处理，校正0.2%，生成26.7%的吲哚。b、，只有用正确的sgRNA处理后，BE3才能纠正3.3%的核感染人类乳腺癌细胞中与癌症相关的p53 Y163C突变。用wt Cas9和供体ssDNA对这些细胞进行相同处理后，没有检测到8.0%独立形成的突变修正。
扩展数据图9
扩展数据图9。ClinVar的遗传变异原则上可以通过碱基编辑进行纠正
对NCBI ClinVar人类遗传变异及其相应表型数据库（见正文参考4）进行了搜索，以查找可通过当前基础编辑技术纠正的遗传病。通过实施左侧列出的连续限制来过滤结果。x轴以对数刻度显示满足该限制和所有上述限制的出现次数。
图1
图1。BE1介导特异性、引导RNA程序化的C→U转化在体外
a、，基本编辑策略。目标C（红色）位于导向RNA（绿色）指定的位点的DNA与dCas9（蓝色）结合，dCas9介导局部DNA链分离。由栓系APOBEC1酶（红色）进行的胞苷脱氨基将单链靶C→U转化。产生的G:U异源双链可在DNA复制或DNA修复后永久转化为a:T bp。b、，脱氨分析显示BE1活性窗口约为5 nt。样品按方法制备。每条通道都根据目标C在原间隔层中的位置进行标记，如果没有目标C，则标记为“–”，将PAM远端的基底作为位置1。c、，脱氨基分析显示BE1的序列特异性和sgRNA-依赖性。DNA底物b条用BE1和正确的sgRNA、不匹配的sgRNA或没有sgRNA孵育。阳性对照样品使用在位置7处带有U的合成DNA底物。凝胶源数据见补充图1。
图2
图2。序列上下文和目标C位置对基础编辑效率的影响在体外
a、，改变目标C周围的顺序对编辑效率的影响在体外C的80%目标链的脱氨率（两条链总测序读数的40%）7原间隔序列5′-TTATTC类GTGGATTTATTA-3′被定义为1.0，并且显示了在1-6和8-13位置包含所有可能的单碱基突变的底物的相对脱氨基效率。b、，每个NC图案的位置对编辑效率的影响在体外。如右图所示，每个NC目标基序在原间隔区内的位置1到8之间变化。PAM显示为蓝色。该图显示了与BE1孵育后，每个编号的靶C位置包含T的总DNA测序读数的百分比。注意，最大可能脱氨产率在体外是总测序读取数的50%（目标链的100%）。数值和误差条反映了三个（一)或两个（用于b条)在不同的日子进行独立的生物复制。
图3
图3。人体细胞中的碱基编辑
a、，哺乳动物细胞中可能的基础编辑结果。初始编辑会导致U:G不匹配。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）对U的识别和切除启动了碱基切除修复（BER），导致还原到C:G起始状态。BE2和BE3抑制UDG，从而阻碍BER。U:G失配也通过失配修复（MMR）处理，MMR优先修复失配的刻痕链。BE3刻痕包含G的非编辑链，有利于解决U:G不匹配到所需的U:A或T:A结果。b、，按照方法中的描述处理HEK293T细胞。显示了用BE1、BE2或BE3治疗或用wt Cas9用供体HDR模板治疗时，在所示的靶位置用T进行总DNA测序读取的百分比。c、，indel形成的频率（见方法）如下所示b条值见补充表6。对于b条和c（c），值和误差条反映了在不同日期进行的三个独立生物复制的平均值和标准差。
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