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。2016年5月6日；291（19）：9872-81。
doi:10.1074/jbc。M116.7200029。 Epub 2016年3月22日。

巨核细胞中的脑源性神经营养因子

佩德罗·查科恩·费尔南德斯 1, 卡塔琳娜·苏伯里 1, 玛丽亚·科尔扎尼 2, 托马斯·莫罗 2, 塞德里克·盖瓦特 2, 伊夫斯·艾伦·巴德 三
附属公司

巨核细胞中的脑源性神经营养因子

佩德罗·查科恩·费尔南德斯等。 生物化学杂志。 。

摘要

到目前为止，内源性脑源性神经营养因子（BDNF）的生物合成已经在神经元中进行了检测，在神经元中，BDNF以一种活动依赖的方式以非常低的水平表达。众所周知，BDNF在人体循环血小板中积累的水平远高于大脑中的水平。在凝血过程中，BDNF从血小板中释放，这导致它作为一种容易获得的生物标志物被广泛使用，前提是血清水平可能以某种方式反映大脑水平。为了确定血小板中BDNF的细胞来源，我们建立了巨核细胞（血小板的祖细胞）的原代培养，我们发现人类和大鼠巨核细胞表达BDNF基因。令人惊讶的是，mRNA转录物的模式与神经元相似。在存在thapsigargin和外部钙的情况下，导致有效BDNF翻译的mRNA物种的水平迅速增加。在这些条件下，生物活性BDNF的必需前体-前BDNF很容易被检测到。巨核细胞将BDNF储存在α颗粒中，其中80%以上还含有血小板因子4。相反，在小鼠巨核细胞中检测不到BDNF，这与小鼠血清中不存在BDNF一致。这些发现表明，抑郁症或体育锻炼研究中报告的人类血清BDNF水平的变化可能主要反映巨核细胞和血小板发生的变化，包括后者保留和释放BDNF的能力。

关键词：血液；脑源性神经营养因子（BDNF）；神经生物学；神经化学；神经营养素。

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数字

图1。
图1。
小鼠、大鼠和人类巨核细胞和血小板中BDNF蛋白的差异水平。培养Mks的Western blot裂解物(A类)和血小板(B类)如图所示。每条泳道装载80微克蛋白质，将印迹膜与Icosagen（爱沙尼亚塔尔图）开发的小鼠单克隆抗体3C11孵育。重组BDNF和前BDNF作为分子质量标记物，β-肌动蛋白抗体作为负荷对照。星号(右上面板)指向与BDNF无关的条带，可能与小鼠样本中的免疫球蛋白轻链相对应。注意小鼠Mks和血小板中没有BDNF。C、，BDNF 9抗体(绿色)（15）和PF4(红色)揭示两种抗原在成熟大鼠和人类Mks中的表达。注意，与PF4不同，BDNF在小鼠Mks中无法检测到。BDNF与PF4在大鼠和人类Mks中的共同定位使用每个通道特定生成的像素强度进行量化。在人类中，83%和大鼠中，86%的BDNF阳性颗粒也呈PF4阳性。蓝色DAPI染色。D、，肌动蛋白的免疫荧光染色(红色)和BDNF(绿色)在前血小板形成培养的人类Mks中。箭头表明BDNF在初生芽中积累。
图2。
图2。
转录分析BDNF公司在小鼠、大鼠和人类巨核细胞中。常规(A类)和实时定量(B类)用外显子特异性引物和成熟培养的成年海马Mks提取的RNA进行PCR(河马)图中显示了、和肺。请注意，在小鼠中，未检测到神经元特异性转录物，包括外显子I和IV，相反，转录物模式类似于肺组织中观察到的非神经元模式。相反，从大鼠和人类Mk中提取的RNA具有转录模式，包括外显子I和IV，如海马所示，这是神经元模式的特征。除非注明为不重要(不另说明。)，所有值均为平均值±S.E.，一式三份，基于三个独立实验第页<0.001（成对吨测试）。
图3。
图3。
上调Bdnf公司thapsigargin的mRNA。细胞外钙的影响。剂量反应(A类)和时间进程(B类)第页，共页Bdnf公司thapsigargin治疗后大鼠Mks的mRNA表达。纯化的成熟大鼠Mk在存在或不存在所示浓度的thapsigargin或载体（DMSO）的情况下培养(A类)以及不同的时间长度(B类). 提取总mRNA并进行反转录，然后使用特异性引物对编码序列进行实时定量PCR扩增得到的cDNABdnf公司。C、，thapsigargin诱导的细胞外钙依赖Bdnf公司mRNA增加。大鼠Mks预孵育2.5 m米37°C下EGTA 1.5小时，然后10 n米用特异性引物对thapsigargin的编码序列进行实时定量PCR，分析其mRNA表达Bdnf公司(客户尽职调查)或外显子特异性引物。所有值均为平均值±S.E.，一式三份，基于三个独立实验。除非另有说明，否则将所有统计值与对照进行比较。*，第页< 0.05; ***,第页<0.001（成对吨测试）。
图4。
图4。
thapsigargin对大鼠Mks中前BDNF、成熟BDNF和前肽的影响。剂量反应(A类)和时间进程(B类)显示了thapsigargin治疗后大鼠Mks产生的前BDNF和成熟BDNF蛋白。成熟的Mks在指定剂量的thapsigargin下培养16小时(A类)或10 n米指定时间的thapsigargin(B类). 每条泳道装载40微克蛋白质，将印迹膜与Icosagen开发的小鼠单克隆抗体3C11孵育。箭头表示前BDNF的中间蛋白水解产物(C类). 10n孵育大鼠Mks产生的前BDNF和前肽蛋白的时间进程米指定时间段内的thapsigargin。每条泳道装载80微克蛋白质，将印迹膜与GeneCopeia，Inc.开发的小鼠单克隆抗体H1001G孵育。所示的印迹是具有类似结果的三个独立实验的代表。图表显示三个单独实验的斑点定量密度值的平均值±S.E.。***，第页<0.001（成对吨测试对比了相应的控制）。重组BDNF（150–300 pg）、抗劈裂重组原-BDNF（0.5–1 ng）和重组前肽（1–10 ng）用作分子质量标记物，β-肌动蛋白抗体用作负荷对照。
图5。
图5。
原代MKs中前蛋白转化酶的差异表达。常规(A类)和实时定量(B类)显示了使用特定引物和从成熟培养大鼠Mks和成年海马提取的RNA进行PCR。请注意，尽管成绩单，包括Pcsk1、PcsK2、Pcsk4、，和5件，在海马组织中表达，在Mks中未检测到(A类). 两种组织中表达的前蛋白转化酶的比较表达水平如所示B类.所有值均为三份平均值±S.E.，并基于三个独立实验。
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