TLR3-/4-Priming Differentially Promotes Ca(2+) Signaling and Cytokine Expression and Ca(2+)-Dependently Augments Cytokine Release in hMSCs

doi:10.1038/srep23103

.2016年3月16日6:23103。

doi:10.1038/srep23103。

TLR3-/4启动不同程度促进hMSCs中Ca（2+）信号转导和细胞因子表达及Ca（2+）依赖性增加细胞因子释放

附属公司

¹韩国安山汉阳大学分子与生命科学系。
²瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院L1，SE-171 76，卡罗林斯卡研究所，罗尔夫·卢夫特糖尿病和内分泌研究中心。
^三韩国水原成均馆大学医学院生理学系。

PMID： 26980664
PMCID公司：项目经理4793222
内政部： 10.1038/srep23103

TLR3-/4启动不同程度促进hMSCs中Ca（2+）信号转导和细胞因子表达及Ca（2+）依赖性增加细胞因子释放

京山公园等。科学代表. 2016.

.2016年3月16日6:23103。

doi:10.1038/srep23103。

附属公司

¹韩国安山汉阳大学分子与生命科学系。
²瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院L1，SE-171 76，卡罗林斯卡研究所，罗尔夫·卢夫特糖尿病和内分泌研究中心。
^三韩国水原成均馆大学医学院生理学系。

PMID： 26980664
PMCID公司：项目经理4793222
内政部： 10.1038/srep23103

摘要

在人类间充质干细胞（hMSCs）中，类toll受体3（TLR3）和TLR4通过识别其配体并刺激包括细胞因子释放在内的下游过程，在组织修复过程中发挥关键作用。人骨髓间充质干细胞释放TLR3-和TLR4-介导的细胞因子的机制尚不明确。在这里，我们表明，暴露于TLR3激动剂聚肌苷-多囊藻酸（poly（I:C））或与TLR4激动剂脂多糖（LPS）孵育可增加hMSCs中TLR3、TLR4和细胞因子的mRNA表达水平。聚（I:C）暴露而非LPS孵育不仅提高了肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）的表达和IP3R介导的Ca（2+）释放，还促进了Orai和STIM的表达以及储存操作的Ca的进入hMSCs。此外，通过RNA测序分析，我们还观察到21个Ca（2+）信号基因在hMSCs TLR3启动后显著上调。poly（I:C）和LPS暴露均增强hMSCs释放细胞因子。siRNA敲除和细胞内Ca（2+）螯合后，增强的细胞因子释放消失。这些数据表明TLR3-和TLR4-priming可不同程度地增强Ca（2+）信号和细胞因子的表达，Ca（2+）依赖性增强hMSCs中细胞因子的释放。

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数字

**图1。TLR4-primed hMSCs的特性。**
(一)流式细胞术分析显示hMSC的免疫表型。hMSCs表达CD44、CD29、CD90、CD105和CD73。(b条)使用干细胞标记基因进行RT-PCR确认。RT-PCR分析使用干细胞标记物OCT4、SOX2、OPN、CXCR4和COL10A1。GAPDH被用作内源性对照。(**c（c）**)正常条件下的hMSC形态（左），放大100倍。放大400倍显示分化为脂肪细胞（中间）或成骨细胞（右侧）的潜能。脂肪细胞或成骨细胞用FABP4或骨钙素抗体（绿色）染色，细胞核用DAPI（蓝色）复染。

**图2。基底[Ca²⁺]_我图案和Ca²⁺hMSCs的释放和进入途径。**
(一)hMSCs根据其基础[Ca分为两类²⁺]_我剖面图，其中一个显示自发[Ca²⁺]_我振荡（下面板），另一个显示出稳定的静止状态[Ca²⁺]_我（上面板）。(b条)代表[Ca²⁺]_我细胞外钙存在和不存在时hMSCs对150 mM KCl和50μM卡巴胆碱（CCH）的反应²⁺. (**c（c）**)代表[Ca²⁺]_我SERCA抑制剂CPA（10μM）对hMSCs的影响²⁺. (d日)代表[Ca²⁺]_我显示[Ca的记录道²⁺]_我在缺乏细胞外钙的情况下接触10μM CPA后的情况²⁺.加州²⁺细胞外添加4 mM Ca引起的内流²⁺hMSCs中膜透性SOCE拮抗剂2APB（50μM）对其消除作用。(**e（电子）**)[加利福尼亚州²⁺]_我在缺乏细胞外钙的情况下，用咖啡因（10 mM）处理的hMSCs的轮廓²⁺.

**图3。暴露于LPS或Poly（I:C）可提高hMSCs中TLR3和细胞因子的mRNA表达。**
(一,b条)传统和实时RT-PCR分析和定量结果表明，TLR3和TLR4 mRNA表达水平在接触LPS或poly（I:C）后以浓度和时间依赖性的方式增加。LPS（10 ng/ml）提高TLR3 mRNA的表达。聚（I:C）浓度依赖性地增加TLR3 mRNA的表达。用两种配体孵育4小时，TLR3和TLR4 mRNA水平最好升高。β-肌动蛋白起内部控制作用。(**c（c）**)实时RT-PCR分析显示，LPS和poly（I:C）孵育4 h后，hMSCs中细胞因子（包括IL4、IL6、IL8和IP10）的mRNA表达上调。LPS最好能促进IL6、IL8和IP10 mRNA的表达，而poly（I:C）只提高IL4的mRNA水平。显著性水平设定为*p<0.05。

**图4。使用LPS或Poly（I:C）治疗可增加IP_三R表达和IP_三R介导的钙²⁺不影响二氢吡啶敏感钙的动员²⁺hMSCs中的条目。**
(一)代表[Ca²⁺]_我卡巴胆碱诱发的痕迹²⁺]_我在四个沐浴在没有Ca的细胞外溶液中的单个细胞中记录的瞬态²⁺（左侧面板）。平均值[Ca²⁺]_我描绘平均值的迹线[Ca²⁺]_我对照细胞（CTL；n=26细胞）和经LPS（n=43细胞）或poly（I:C）（n=61细胞）处理的细胞在缺乏细胞外钙的情况下对卡巴胆碱激发的反应²⁺. (b条)上图显示了[Ca的平均净增长²⁺]_我由对照组（CTL；n=9）、LPS-（n=9，poly（I:C）治疗组（n=8）获得的平均δF340/F380比值反映。下图显示了接受对照治疗（n=19）、暴露于LPS（n=18）和与poly（I:C）孵育的carbachol-responsive细胞的平均百分比。其中，n表示实验次数。(**c（c）**)代表性RT-PCR印迹显示三种IP的mRNA表达_三对照细胞中的R亚型（ITPR1、ITPR2和ITPR3）和两种RyR亚类型（RYR1和RYR2）。GAPDH作为内部控制。NC表示阴性对照，即蒸馏水。实时RT-PCR定量显示三种IP的不同mRNA表达谱_三对照组、LPS组和poly（I:C）组中的R亚型（ITPR1、ITPR2和ITPR3）。实验进行了三次。(d日)显示IP不同强度的共焦图像_三对照细胞（左侧面板）和暴露于LPS（中间面板）或poly（I:C）（右侧面板）的细胞中的R3免疫荧光。(**e（电子）**)IP的典型western印迹_三对照细胞和暴露于LPS或poly（I:C）（左侧面板）的细胞中的R3。显示IP规范化水平的汇总图_三指示条件下的R（右侧面板）。Pan-Cadherin用作负荷控制。实验进行了六次。显著性水平设定为*p<0.05或**p<0.005。

**图5。用Poly（I:C）而不是LPS孵育可以增强hMSCs中Orai和STIM的表达和SOCE。**
(一)平均值[Ca²⁺]_我显示[Ca的记录道²⁺]_我CPA刺激诱发的瞬变（第一次）和细胞外Ca添加诱发的瞬变²⁺（第二）对照组（n=40个细胞）、LPS-（n=79个细胞）和poly（I:C）处理的细胞（n=30个细胞）浸泡在Ca中²⁺-游离细胞外液。(b条)图解[Ca平均净增长的汇总图²⁺]_我由对照组、LPS或聚（I:C）治疗组记录的平均δF340/F380比值反映。实验进行了16次。(**c（c）**)显示[Ca平均净增长的汇总图²⁺]_我通过胞外应用4 mM Ca后的平均δF340/F380比率反映²⁺在对照中，LPS或poly（I:C）处理的具有细胞内Ca的细胞²⁺CPA预先清空的门店。实验进行了16次。(d日)代表性RT-PCR印迹（上图）显示了对照细胞中三种Orai亚型和两种STIM亚型的mRNA表达水平。NC表示使用蒸馏水的阴性对照。实时RT-PCR定量（下面板）显示了对照组（n=3）、LPS组（n=3）和poly（I:C）组（n=2）中三种Orai亚型（Orai1、Orai2和Orai3）和两种STIM亚型的不同mRNA表达谱。(**e（电子）**)共聚焦图像显示对照细胞（上面板）和暴露于LPS（中面板）或poly（I:C）（下面板）的细胞中Orai1和Orai2免疫荧光的不同强度。(**（f）**)对照细胞和暴露于LPS或poly（I:C）的细胞中Orai2的代表性western blot（左面板）。汇总图显示了所示条件下Orai2的标准化水平。β-actin作为负荷对照。实验进行了四次（右侧面板）。(克)显示基础[Ca的汇总图²⁺]_我通过在对照细胞和暴露于LPS或poly（I:C）的细胞中应用CPA之前记录的平均F340/F380比率反映。实验进行了19次。显著性水平设定为*p<0.05或**p<0.005。

**图6。LPS或Poly（I:C）刺激促进Ca中细胞因子释放²⁺hMSCs中的依赖方式。**
(一)ELISA分析显示，与对照细胞相比，暴露于LPS或poly（I:C）的细胞释放IL6、IL8、IP10和RANTES更为明显。实验进行了三次。(b条–d日)ELISA分析证明细胞内钙螯合作用对IL6、RANTES和IFN-α释放的消融²⁺使用BAPTA/AM（5μM）和来自LPS或poly（I:C）处理细胞的siRNA。实验进行了三次。(**e（电子）**)实时RT-PCR定量显示了对照组和poly（I:C）中ITPR3、Orai2和Stim1 mRNA的表达情况，包括BAPTA/AM和不含BAPTA/AM。实验进行了三次。(**（f）**)ELISA分析证明ITPR3敲除（ITPR3-siRNA）消融IL6释放。实验进行了六次。显著性水平设定为*p<0.05或**p<0.005。

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1. Liechty K.W.等人。人间充质干细胞移植并在绵羊子宫内移植后显示出位点特异性分化。《国家医学》第6卷，第1282–1286页（2000年）。-公共医学
1. Ryan J.M.、Barry F.P.、Murphy J.M和Mahon B.P.骨髓间充质干细胞可避免异基因排斥。《炎症杂志》（伦敦）2，8（2005）。-项目管理委员会-公共医学
1. Tomchuck S.L.等人。人类间充质干细胞上的Toll样受体驱动其迁移和免疫调节反应。干细胞26，99–107（2008）。-项目管理委员会-公共医学
1. Pevsner-Fischer M.等人。Toll样受体及其配体控制间充质干细胞功能。《血液》109，1422-1432（2007）。-公共医学

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[1] Pittenger M.F.等人。成人间充质干细胞的多系潜能。《科学》284143-147（1999）。-公共医学

[2] Pittenger M.F.等人。成人间充质干细胞的多系潜能。《科学》284143-147（1999）。-公共医学

[3] Liechty K.W.等人。人间充质干细胞移植并在绵羊子宫内移植后显示出位点特异性分化。《国家医学》第6卷，第1282–1286页（2000年）。-公共医学

[4] Liechty K.W.等人。人间充质干细胞移植并在绵羊子宫内移植后显示出位点特异性分化。《国家医学》第6卷，第1282–1286页（2000年）。-公共医学

[5] Ryan J.M.、Barry F.P.、Murphy J.M和Mahon B.P.骨髓间充质干细胞可避免异基因排斥。《炎症杂志》（伦敦）2，8（2005）。-项目管理委员会-公共医学

[6] Ryan J.M.、Barry F.P.、Murphy J.M和Mahon B.P.骨髓间充质干细胞可避免异基因排斥。《炎症杂志》（伦敦）2，8（2005）。-项目管理委员会-公共医学

[7] Tomchuck S.L.等人。人类间充质干细胞上的Toll样受体驱动其迁移和免疫调节反应。干细胞26，99–107（2008）。-项目管理委员会-公共医学

[8] Tomchuck S.L.等人。人类间充质干细胞上的Toll样受体驱动其迁移和免疫调节反应。干细胞26，99–107（2008）。-项目管理委员会-公共医学

[9] Pevsner-Fischer M.等人。Toll样受体及其配体控制间充质干细胞功能。《血液》109，1422-1432（2007）。-公共医学

[10] Pevsner-Fischer M.等人。Toll样受体及其配体控制间充质干细胞功能。《血液》109，1422-1432（2007）。-公共医学

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