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.2016年5月6日；291(19):10277-92.
doi:10.1074/jbc。M115.692244。 Epub 2016年2月24日。

Sirtuin 3（SIRT3）通过琥珀酸脱氢酶-G蛋白偶联受体91（GPR91）途径调节肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的生成

李英辉 1, Dae Hee Choi先生 1, 李恩惠 2, 苏龙修（Su Ryeon Seo） 2, Seungkoo Lee先生 三, Eun-Hee Cho先生 4
附属公司

Sirtuin 3（SIRT3）通过琥珀酸脱氢酶-G蛋白偶联受体91（GPR91）途径调节肝星状细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的生成

李英辉等。 生物化学杂志. .

摘要

Sirtuin 3（SIRT3）是一种NAD（+）依赖性蛋白脱乙酰酶。最近的研究表明，SIRT3在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中的表达降低。此外，SIRT3是琥珀酸脱氢酶（SDH）的关键调节因子，可以催化琥珀酸氧化为富马酸。琥珀酸浓度增加和特异性G蛋白偶联受体91（GPR91）参与肝星状细胞（HSC）的激活。在本研究中，我们旨在确定SIRT3是否调节HSC和NAFLD动物模型中SDH活性、琥珀酸和GPR91的表达。我们的目标也是确定肝细胞释放的琥珀酸是否调节HSC激活。使用SIRT3 siRNA抑制SIRT3可通过SDH-琥珀酸-GPR91途径加剧HSC激活，SIRT3过表达或和厚朴酚治疗可减弱体外HSC激活，琥珀酸浓度和GPR91表达增加。此外，我们发现GPR91敲除或白藜芦醇治疗改善了MCD饮食喂养小鼠的脂肪变性。这项研究揭示了SIRT3-SDH-GPR91级联在MCD饮食诱导的NAFLD HSC激活中的新机制。这些发现突出了旨在改善NAFLD治疗的HSC中针对SIRT3和GPR91的新策略的生物学意义。

关键词：G蛋白偶联受体（GPCR）；肝星状细胞；肝细胞；肝损伤；西尔图。

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数字

图1。
图1。
琥珀酸、琥珀酸脱氢酶活性，以及LX2细胞中GPR91和α-SMA的表达。 A类，LX2细胞在琥珀酸（400μ米)24h，收获前2h添加U1026。用所示抗体对全细胞裂解物进行蛋白质印迹分析(左侧面板). 使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）计算波段强度(右侧面板). ***,第页< 0.001与控制。B类，LX2细胞在有或无丙二酸盐（3 m米)24小时后，用Western blotting分析GPR91和a-SMA蛋白水平(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底板). ***,第页< 0.001与控制。C类，LX2细胞在对照组或丙二酸盐（3 m米)24小时后，在全细胞裂解物中测量SDH活性。***，第页< 0.001与控制。D类，LX2细胞在有或无丙二酸盐（3 m米)24小时后，在全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。E类，LX2细胞在有或无D-苹果酸（1 m米)24小时后，用Western blotting分析GPR91和a-SMA蛋白水平(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制。F类，LX2细胞在有或无D-苹果酸（1 m米)24小时后，在全细胞裂解液中测定富马酸酶活性，第页< 0.001与控制。G公司，LX2细胞在有或无D-苹果酸（1 m米)并在全细胞裂解物中测量SDH活性。***，第页< 0.001与控制。H（H），LX2细胞在有或无D-苹果酸（1 m米)24小时后，在全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。
图2。
图2。
通过siRNA-介导的SIRT3敲除上调LX2细胞中的GPR91、α-SMA、TGFβ1和胶原蛋白1型。 A类用RT-PCR分析转染SIRT3 siRNA或对照siRNA的HSC中SIRT3、GPR91、α-SMA、TGF-β1和I型胶原mRNA的表达。B类，定量分析带密度。每列代表平均值±S.E.**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与控制）。
图3。
图3。
SIRT3对SDH-GPR91-α-SMA信号通路的调节。 A类、SIRT3、GPR91、α-SMA、TGF-β1和I型胶原蛋白在LX2细胞中表达的Western blotting分析（有或无SIRT3敲除）。将水平归一化为GAPDH的表达(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制siRNA。B类用SIRT3 siRNA或对照siRNA转染LX2细胞24小时，并在全细胞裂解物中测量SDH活性，第页< 0.001与对照siRNA。C类，LX2细胞转染SIRT3 siRNA或对照siRNA 24 h，琥珀酸浓度(浓度。)在全细胞裂解物中测量，第页< 0.001与控制siRNA。D类将SIRT3 siRNA或对照siRNA转染LX2细胞24 h，然后免疫沉淀LX2(IP（IP）)抗SDHA单克隆抗体。用免疫印迹法检测SDHA乙酰化(左侧面板). 使用ImageJ软件计算带强度(右侧面板). ***,第页< 0.001与控制siRNA。E类，通过转染人SIRT3腺病毒过度表达SIRT3(广告-SIRT3)或表达LacZ的对照腺病毒(广告-CMV-β-加仑)MOI为30。24小时后，对感染的LX2细胞进行裂解并进行Western blotting(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制腺病毒。F类，用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal转染LX2细胞，MOI为30。24小时后，裂解感染细胞，并测量SDH活性。***，第页< 0.001与控制腺病毒。G公司，在MOI为30时，用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal转染LX2细胞。24小时后，裂解感染细胞并测量琥珀酸浓度***第页< 0.001,与控制腺病毒。H（H）在MOI为30时，用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal转染LX2细胞。24小时后，用SDHA单克隆抗体免疫沉淀感染细胞。用免疫印迹法检测SDHA乙酰化(左侧面板). 使用ImageJ软件计算带强度(正确的). ***,第页< 0.001与对照腺病毒。
图4。
图4。
棕榈酸缺乏和MCD培养基对LX2细胞SIRT3和GPR91表达的影响。 A类用或不用棕榈酸处理LX2细胞20 h。随后，用Western blotting检测SIRT3、GPR91和α-SMA(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制。B类用或不用棕榈酸处理LX2细胞20 h，用RT-PCR分析检测SIRT3 mRNA(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制。C类，LX2细胞在对照或MCD培养基中培养24 h。制备细胞裂解物，并用Western blotting分析SIRT3、GPR91和α-SMA蛋白水平(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). *,第页< 0.05; ***,第页< 0.001 (与控制介质）。D类，LX2细胞在对照或MCD培养基中培养24 h，并用RT-PCR分析检测SIRT3 mRNA(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底板). ***,第页< 0.001与控制介质。
图5。
图5。
SIRT3过表达减弱棕榈酸酯和MCD介质诱导的HSC激活。 A类在MOI为30时，用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal转染LX2细胞。8小时后，用或不用棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，然后将细胞溶解并进行Western印迹(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与控制）。B类在MOI为30时，用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal转染LX2细胞。8小时后，用或不用棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，在全细胞裂解物中测量SDH活性。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与控制）。C类在MOI为30时，用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal转染LX2细胞。8小时后，用或不用棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，在全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。D类在转染前，将LX2细胞改为对照或MCD培养基。然后在MOI为30时用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal感染LX2细胞。感染后24小时，细胞被裂解并进行Western blotting(顶部面板). 使用ImageJ软件计算条带强度(底部面板). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与控制）。E类在转染前，将LX2细胞改为对照或MCD培养基。然后在MOI为30时用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal感染LX2细胞。感染后24小时，在全细胞裂解物中测量SDH活性。**，第页< 0.01与控制介质。F类在转染前，将LX2细胞改为对照或MCD培养基。然后用Ad-SIRT3或Ad-CMV-β-gal以30的MOI感染LX2细胞。感染后24小时，在全细胞裂解物中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制介质。
图6。
图6。
厚朴酚通过SIRT3-SDH-琥珀酸途径减弱棕榈酸酯和MCD介质诱导的HSC活化。 A类用和厚朴酚（10μ米). 4小时后，将细胞与棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，然后将细胞溶解并进行Western印迹(顶部). 使用ImageJ软件（NIH）计算带强度(底部). ***第页< 0.001,与控制。B类用和厚朴酚（10μ米). 4小时后，将细胞与棕榈酸酯（300μ米)并在全细胞裂解物中测量SDH活性。***，第页< 0.001与控制。C类用和厚朴酚（10μ米). 4小时后，将细胞与棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，在全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。D类将LX2细胞换成对照或MCD培养基。然后用和厚朴酚（10μ米)24小时，将细胞溶解并进行Western blotting(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部). ***,第页< 0.001与控制。E类将LX2细胞换成对照或MCD培养基。然后用和厚朴酚（10μ米)24小时后，在全细胞裂解物中测量SDH活性。***，第页< 0.001与控制介质。F类将LX2细胞换成对照或MCD培养基。然后用和厚朴酚（10μ米)24小时后，在全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制介质。
图7。
图7。
AAV-GPR91 shRNA-介导的GPR91敲除改变了NAFLD MCD饮食喂养小鼠模型分离HSC和肝脏中α-SMA的表达。 A类在MCD饮食喂养的第一天，用AAV-GPR91 shRNA或AAV6-GFP（对照shRNA）处理MCD饮食饲养小鼠。用H&E染色评价肝脏脂肪变性。B类在MCD饮食喂养的第一天，用AAV-GPR91 shRNA或AAV6-GFP（对照shRNA）处理MCD饮食饲养小鼠。还进行了Masson三色染色。C类，在MCD日粮喂养的第一天，用AAV-GPR91 shRNA或AAV6-GFP（对照shRNA）处理MCD日粮喂养的小鼠。用免疫组织化学方法检测GPR91的表达。D类在MCD饮食喂养的第一天，用AAV-GPR91 shRNA或AAV6-GFP（对照shRNA）处理MCD饮食饲养小鼠。免疫组织化学检测α-SMA的表达。E类在MCD饮食喂养的第一天，用AAV-GPR91 shRNA或AAV6-GFP（对照shRNA）处理MCD饮食饲养小鼠。对肝脏进行溶解并进行蛋白质印迹(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与饮食。F类在MCD饮食喂养的第一天，用AAV-GPR91 shRNA或AAV6-GFP（对照shRNA）处理MCD饮食饲养小鼠。分离HSC并进行Western blotting(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001与饮食。
图8。
图8。
白藜芦醇对非酒精性脂肪肝MCD饮食喂养小鼠模型分离HSC和肝脏中GPR91和α-SMA表达的影响。 A类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。用H&E染色评价肝脏脂肪变性。B类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。进行Masson三色染色。C类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。用免疫组织化学方法检测GPR91的表达。D类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。免疫组织化学检测α-SMA的表达。E类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。将肝脏溶解并进行蛋白质印迹(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与饮食）。F类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。分离HSC并进行Western blotting(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). *,第页< 0.05; ***,第页< 0.001 (与饮食）。
图9。
图9。
白藜芦醇对非酒精性脂肪肝MCD饮食小鼠模型肝脏SIRT3表达的影响。 A类、MCD饮食喂养小鼠分别服用或不服用白藜芦醇。免疫组织化学检测SIRT3的表达。B类HSP60的代表性免疫荧光双重染色(绿色)和SIRT3(红色). 合并的图像显示在正确的。C类用AAV-GPR91 shRNA或白藜芦醇和甘油三酯治疗MCD饮食喂养小鼠(TG公司)测定肝脏中的含量，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与饮食）。
图10。
图10。
棕榈酸酯和MCD培养基处理对饮食喂养小鼠肝细胞的影响。 A类用棕榈酸（300μ米)持续20小时，使用Western blotting测定SIRT3蛋白水平(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制。B类用棕榈酸（300μ米)并在全细胞裂解物中测量SDH活性。**，第页< 0.01,与控制。C类用棕榈酸（300μ米)持续20小时，在全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。D类，将从饮食喂养小鼠的肝脏中分离的原代肝细胞在对照或MCD培养基中培养24 h，并用Western blotting测定SIRT3蛋白水平(顶部面板). 使用ImageJ软件计算带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制介质。E类，从饮食喂养小鼠的肝脏中分离出的原代肝细胞在对照或MCD培养基中培养24 h，并在全细胞裂解物中测量SDH活性，第页< 0.001与控制介质。F类，从饮食喂养小鼠的肝脏中分离出的原代肝细胞在对照或MCD培养基中培养24 h，并测量全细胞裂解液中的琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制介质。
图11。
图11。
棕榈酸对肝细胞CM活化的影响在体外. A类，小鼠肝细胞和肝星状细胞的细胞对细胞实验示意图。B类，AML12细胞用或不用棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，测量SDH活性。***，第页< 0.001与控制。C类，AML12细胞用或不用棕榈酸酯（300μ米)持续20小时，测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。D类将棕榈酸处理的AML12细胞中的CM转移到LX2细胞中20 h，并对LX2中的指示抗体进行Western blotting分析(顶部面板). 使用ImageJ软件计算条带强度(底部面板). ***,第页< 0.001与控制。E类，将棕榈酸处理的AML12细胞中的CM转移到LX2细胞中20 h，并在LX2的全细胞裂解液中测量SDH活性，第页< 0.001与控制。F类，将棕榈酸处理的AML12细胞中的CM转移到LX2细胞中20 h，并在LX2电池的全细胞裂解液中测量琥珀酸浓度，第页< 0.001与控制。
图12。
图12。
HSC和肝细胞中的SIRT3、SDH和GPR91信号通路。每个实线和箭头表示激活途径中的一个步骤虚线和箭头表示抑制途径中的一个步骤。棕榈酸酯降低SIR3活性，从而降低肝细胞和HSC中的SDH活性。肝细胞或HSC中SDH活性降低导致琥珀酸积累增加，从细胞液中移出并激活HSC中的GPR91，从而产生α-SMA、TGF-β1和I型胶原蛋白。
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