Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation

doi:10.1038/srep21387

.2016年2月24日6:21387。

doi:10.1038/srep21387。

硬化水凝胶用于研究肌成纤维细胞激活过程中肝星状细胞机械转导的动力学

史蒂文·卡利亚里¹, 玛丽娜·佩雷佩利尤克², 布莱恩·德·科斯格罗夫¹, Shannon J Tsai先生², 李吉云¹, 罗伯特·L·莫克^1 三, 丽贝卡·G·威尔斯², 杰森·A·伯迪克¹

附属公司

¹宾夕法尼亚大学生物工程系，费城，PA 19104，美国。
²宾夕法尼亚大学医学系，费城，宾夕法尼亚19104，美国。
^三宾夕法尼亚大学矫形外科，费城，PA 19104，美国。

PMID： 26906177
PMCID公司：项目经理4764908
内政部： 10.1038/srep21387

硬化水凝胶用于研究肌成纤维细胞激活过程中肝星状细胞机械转导的动力学

史蒂文·卡利亚里等。科学代表. 2016.

.2016年2月24日6:21387。

doi:10.1038/srep21387。

作者

附属公司

¹宾夕法尼亚大学生物工程系，费城，PA 19104，美国。
²宾夕法尼亚大学医学系，费城，宾夕法尼亚19104，美国。
^三宾夕法尼亚大学矫形外科，费城，PA 19104，美国。

PMID： 26906177
PMCID公司：项目经理4764908
内政部： 10.1038/srep21387

摘要

在发达国家，组织纤维化导致将近一半的死亡，其特征是基质逐渐硬化。尽管如此，几乎所有体外疾病模型都是机械静态的。在这里，我们使用可见光介导的硬化水凝胶来研究疾病相关系统中的细胞机械传导。原发性肝星状细胞依赖水凝胶在后期（分离后恢复期）原位硬化，显示早期（Yes-associated protein/Transcription coactivator with PDZ binding motif，YAP/TAZ）和晚期（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）的信号动力学均加速肌成纤维细胞分化的标志物，导致与体内观察到的激活动力学相似的时间过程。我们进一步验证了该系统，结果表明，在基底硬化后α-SMA抑制导致星状细胞活化减弱，YAP/TAZ核穿梭和牵引力生成减少。总之，这些数据表明，与静态底物相比，硬化水凝胶可能是研究肌成纤维细胞活化的更可靠模型，并可能为疾病治疗学的发展提供信息。

PubMed免责声明

数字

**图1。可见光介导的MeHA凝胶硬化。**
（a）用甲基丙烯酸酯对透明质酸进行改性，以实现加成和自由基交联。(b条)含有RGD的肽与MeHA偶联，然后进行初始Michael型加成反应，形成软凝胶。可见蓝光和光引发剂LAP存在下的自由基聚合使基底变硬。(**c（c）**)显示MeHA在蓝光（3 mW/cm）下硬化的流变剖面²，15分钟，阴影）。闭合圆表示储能模量（G'），开放圆表示损耗模量（G“）。(d日)AFM测量软硬（蓝光：10 mW/cm²，5分钟，LAP:6.6 mM）水凝胶弹性模量(n个 = 每组3粒凝胶，误差条代表标准偏差。）****P（P）* < 0.001.

**图2。肝星状细胞扩散并呈现肌成纤维细胞形态，以应对就地硬化。**
(一)的示意图就地加固过程。(b条)软、硬静态基板以及动态硬化软到硬基板上星形细胞的相位对比图像(就地加固在第4天进行）。比例尺：50μm。(**c（c）**)24小时后典型星状细胞扩散面积定量就地第4天硬化(n个 = 每组3个细胞，每个形状代表一个细胞，其扩散面积每15分钟监测一次）。在软静态组和硬静态组中扩散面积相对恒定，但在软到硬组中稳定增加，尤其是在最初的12小时内(d日)为了确保星状细胞随着刚度而不是自由基的产生而扩散，制备了软的MeHA凝胶，其中剩余的甲基丙烯酸酯被硫醇覆盖，以便在光和引发剂存在下会产生自由基，但不会发生二次交联（硬化）。典型的相位对比图像显示，各组之间的细胞扩散区域没有差异。比例尺：50μm。(**e（电子）**)细胞面积量化证实各组间扩散面积无差异(n个 > 每组22个单元格/时间点，误差条代表标准偏差）。

**图3。延迟硬化促进更快速的YAP/TAZ核移位和α-SMA应力纤维组装。**
(一)实验设计示意图。(b条)星状细胞扩散面积的量化(n个 > 每组12个细胞）(**c（c）**)YAP/TAZ核质强度比(n个 > 每组29个细胞）(d日)细胞分数显示有组织的α-SMA应力纤维(n个 > 每组20个细胞）(**e（电子）**)和细胞分数显示有组织的F-actin应力纤维(n个 > 每组20个细胞）在早期（第1天）或之后（第6天）硬化后1、6、24或72小时（误差条代表s.e.m.）。(**（f）**)第1天或第6天硬化后1小时或72小时细胞的典型相位对比图。(克)代表性免疫染色显示在后期硬化时间点（第6天）YAP/TAZ核移位和α-SMA应力纤维组装更快。虽然在早期硬化（第1天）72小时后YAP/TAZ核定位更为明显，但α-SMA染色仍呈弥散状，且未与F-actin应力纤维共存。相反，在后期硬化后1小时内（第6天）出现YAP/TAZ核易位，硬化后72小时内，大多数星状细胞显示出α-SMA应力纤维。补充信息中介绍了所有实验组的代表性免疫染色。虚线表示第1天（浅蓝色）或第6天（深蓝色）软凝胶上的水平**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001，其中图中所示的比较是第1天和第6天每个后加固时间点的结果（例如，面板内(**c（c）**)加固后1 h第6天YAP/TAZ核强度比显著大于加固后1小时第1天YAP/TAZ核强度，*P（P）* < 0.05). 比例尺：50μm。

**图4。阻断α-SMA聚合导致YAP/TAZ核穿梭减少。**
(一)将星状细胞接种在3天后变硬的软凝胶上，并在正常培养基（BP（−））或添加α-SMA阻断肽（25μg/mL，BP（+））的培养基中培养额外4天。阻断肽几乎完全消除了α-SMA的表达，而不影响其他丝状肌动蛋白，但减少了核YAP/TAZ的积累。比例尺：50μm。(b条)免疫染色定量表明α-SMA阻断不会影响显示F-actin应激纤维的细胞比例(n个 > 每组30个单元格，误差条代表s.e.m.）。(**c（c）**)YAP/TAZ核质强度比的Tukey盒图显示BP（+）组YAP/TAZ核定位显著降低(n个 > 每组30个细胞）****P（P）* < 0.001.

**图5。抑制α-SMA不会改变星状细胞扩散面积，但会显著减少牵引力的产生。**
(一)代表性牵引力矢量图和相位对比图显示了BP（−）组中类似的扩张但更强的牵引。比例尺：50μm。(b条)细胞扩散面积的Tukey盒图量化(n个 > 每组12个细胞）。(**c（c）**)每个单元产生的总力的Tukey盒图量化(n个 > 每组12个细胞）。(d日)平均牵引应力的Tukey盒图量化(n个 > 每组12个细胞）****P（P）* < 0.001.

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1. Desmoulier A.、Darby I.A.和Gabbiani G.正常和病理性软组织重塑：肌成纤维细胞的作用，特别强调肝和肾纤维化。《实验室投资》83，1689–1707（2003）。-公共医学
1. Thannickal V.J.、Toews G.B.、White E.S.、Lynch Iii J.P.和Martinez F.J.肺纤维化的机制。《医学年鉴》55，395–417（2004）。-公共医学
1. Mederacke I.等人。命运追踪显示肝星状细胞是独立于病因的肝纤维化的主要贡献者。Nat Commun 4，2823（2013）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. 世界卫生组织，《特定原因死亡率：2000-2011年区域估计数》。（2012）网址：http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/estimates_regional_2。。。。（访问时间：2015年11月30日）。

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[2] Wynn T.A.纤维化的细胞和分子机制。《病理学杂志》214199-210（2008）。-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Desmoulier A.、Darby I.A.和Gabbiani G.正常和病理性软组织重塑：肌成纤维细胞的作用，特别强调肝和肾纤维化。《实验室投资》83，1689–1707（2003）。-公共医学

[4] Desmoulier A.、Darby I.A.和Gabbiani G.正常和病理性软组织重塑：肌成纤维细胞的作用，特别强调肝和肾纤维化。《实验室投资》83，1689–1707（2003）。-公共医学

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[7] Mederacke I.等人。命运追踪显示肝星状细胞是独立于病因的肝纤维化的主要贡献者。Nat Commun 4，2823（2013）。-项目管理咨询公司-公共医学

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[9] 世界卫生组织，《特定原因死亡率：2000-2011年区域估计数》。（2012）网址：http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/estimates_regional_2。。。。（访问时间：2015年11月30日）。

[10] 世界卫生组织，《特定原因死亡率：2000-2011年区域估计数》。（2012）网址：http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/estimates_regional_2。。。。（访问时间：2015年11月30日）。

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