PRDX2 and PRDX4 are negative regulators of hypoxia-inducible factors under conditions of prolonged hypoxia

doi:10.18632/oncotarget.7142

.2016年2月9日；7(6):6379-97.

doi:10.18632/noctarget.7142。

PRDX2和PRDX4是长时间缺氧条件下低氧诱导因子的负调节因子

罗微^1 2 三 4, 陈锡彬¹, 闫晨^三, 杜阿·阿尔卡姆^三, 王英飞^三 5, 格雷格·塞门扎^{1 2 6 7 8 9 10}

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生物化学系。
^三美国德克萨斯州达拉斯UT西南医学中心病理科。
⁴美国德克萨斯州达拉斯UT西南医学中心药理学系。
⁵犹他州西南医学中心神经病学和神经治疗学系，德克萨斯州达拉斯，美国。
⁶美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。
⁷美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科。
⁸美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院医学系。
⁹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院放射肿瘤学系。
¹⁰美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院McKusick-Nathans遗传医学研究所系。

PMID： 26837221
预防性维修识别码：项目经理4872721
内政部： 10.18632/目标7142

PRDX2和PRDX4是长时间缺氧条件下低氧诱导因子的负调节因子

罗微等人。肿瘤靶点. 2016.

.2016年2月9日；7(6):6379-97.

doi:10.18632/noctarget.7142。

作者

罗微^1 2 三 4, 陈锡彬¹, 闫晨^三, 杜阿·阿尔卡姆^三, 王英飞^三 5, 格雷格·塞门扎^{1 2 6 7 8 9 10}

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院细胞工程研究所血管项目。
²美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生物化学系。
^三美国德克萨斯州达拉斯UT西南医学中心病理科。
⁴美国德克萨斯州达拉斯UT西南医学中心药理学系。
⁵犹他州西南医学中心神经病学和神经治疗学系，德克萨斯州达拉斯，美国。
⁶美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系。
⁷美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院儿科。
⁸美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院医学系。
⁹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院放射肿瘤学系。
¹⁰美国马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院McKusick-Nathans遗传医学研究所系。

PMID： 26837221
预防性维修识别码：项目经理4872721
内政部： 10.18632/目标7142

摘要

低氧诱导因子（HIF）控制对癌症和其他人类疾病的发病机制至关重要的基因的转录。缺氧暴露后，HIF的转录活性迅速增加，但一些HIF靶基因的表达在长时间缺氧期间降低。然而，反馈抑制的潜在机制尚未完全理解。在这里，我们报道了过氧化物酶原2（PRDX2）和PRDX4在体外和缺氧HeLa细胞中与HIF-1α和HIF-2α相互作用。长时间缺氧会增加PRDX2和PRDX4的核转位。因此，PRDX2和PRDX4损害HIF-1和HIF-2与HIF靶基因子集的低氧反应元件的结合，从而抑制长期低氧暴露细胞中的基因转录。PRDX2和PRDX4对p300和RNA聚合酶II向HIF靶基因的募集没有影响，抑制HIF-1和HIF-2不需要PRDX2与PRDX4的酶活性。我们还证明了PRDX2是一个直接的HIF靶基因，并且PRDX2的表达是由长期缺氧诱导的。这些发现揭示了在长期缺氧条件下抑制HIF转录活性的新的反馈机制。

关键词：HIF；PRDX2；PRDX4；转录辅抑制因子。

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没有要声明的冲突。

数字

**图1。PRDX蛋白与HIF-1α和HIF-2α结合**
A。用编码V5肽标记的PRDX2（PRDX2-V5）的表达载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O₂24 h。使用抗HIF-1α抗体或对照IgG对全细胞裂解物（WCL）进行免疫沉淀（IP），然后使用V5表位或HIF-1 a抗体进行免疫印迹分析。B。用PRDX2-V5载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O₂24小时后，使用V5抗体或对照IgG对WCL进行IP，然后使用V5或HIF-1α抗体进行免疫印迹分析。轻IgG：来自次级抗体的免疫球蛋白轻链。**C、。**用编码V5标记的PRDX家族成员的载体转染HeLa细胞，并暴露于1%O₂使用抗HIF-1α抗体对WCL进行IP处理24 h，然后使用V5或HIF-1 a抗体进行免疫印迹分析。D。用空载体（EV）或编码V5标记的PRDX家族成员的载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O₂使用抗HIF-2α抗体对WCL进行IP处理24 h，然后使用V5或HIF-2 a抗体进行免疫印迹分析。

**图2。HIF-1αPRDX2和PRDX4结合域的定位**
A。和B。用PRDX2-V5（A）或PRDX4-V5（B）载体转染HeLa细胞，用纯化的GST或GST-HIF-1α融合蛋白在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠存在下孵育WCL，然后用抗V5抗体进行免疫印迹分析（上面板）或Ponceau S染色（下面板）。

**图3。PRDX2和PRDX4抑制HIF-1和HIF-2的转录活性**
A。用HIF依赖性萤火虫萤光素酶（Fluc）报告基因p2.1、雷尼拉萤光素酶（Rluc）对照报告基因pSV雷尼拉和空载体（EV）或PRDX1-6表达载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001.B。和**C、。**用p2.1、pSV-Renilla和EV或编码PRDX2-V5或PRDX4-V5的载体转染小鼠胚胎成纤维细胞（B）或HEK293T细胞（C），并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 3-4).^####第页< 0.0001对20%O时的EV₂;^****第页< 0.0001对1%O时的EV₂.D。用p2.1、pSV-Renilla、EV或PRDX2-V5载体和HIF-1α或HIF-2α载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001.E.公司。用p2.1、pSV-Renilla、EV或PRDX4-V5以及HIF-1α或HIF-2α载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^*第页< 0.05;^**第页< 0.01;^***第页< 0.001.F、。用pGalA表达载体、Fluc报告子pG5E1bLuc、pSV-Renilla和EV或PRDX1-6载体转染HeLa细胞，暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001.

**图4。PRDX2或PRDX4的表达不影响HIF-1α或HIF-2α蛋白水平**
A。和B。用EV或编码PRDX2-V5（A，P2）或PRDX4-V5（B，P4）的载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂对WCL进行抗HIF-1α、HIF-2α、V5或腺苷抗体的免疫印迹分析。**C、。**HeLa-shSC（sc）和HeLa-sh PRDX（2+4）（2+4）细胞暴露于20%或1%的O₂在强力霉素存在下持续24小时。使用HIF-1α、HIF-2α、PRDX2、PRDX4和肌动蛋白抗体对WCL进行免疫印迹分析。

**图5。缺氧诱导PRDX2和PRDX4的核移位**
用编码PRDX2-V5（P2）或PRDX4-V5（P4）的载体或空载体（EV）转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂48 h。分离细胞核和细胞溶质部分，并使用抗HIF-1α、HIF-2α、V5、α-微管蛋白和组蛋白H3的抗体进行免疫印迹分析。

**图6。PRDX2和PRDX4独立于羟化作用抑制HIF-1**
A。和B。HeLa细胞转染HIF-依赖性Fluc报告子p2.1、对照Rluc报告子pSV-Renilla、EV或编码PRDX家族成员的载体以及编码HIF-1α（P402A/P564A）（HIF-1 a-DM）（a）或HIF-1β（P402A/P564A/N803A）（HIF1αTM）（B）的载体。Fluc:Rluc活性归一化为EV（平均值±SEM，n个= 4).^*第页< 0.05;^**第页< 0.01;^***第页< 0.001.

**图7。PRDX2和PRDX4的催化活性对于抑制HIF是必不可少的**
A。用HIF-依赖型Fluc报告子p2.1、对照型Rluc报告子pSV-Renilla和EV或编码野生型（WT）PRDX2-V5或催化非活性PRDX2（C51S）-V5的载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^*第页< 0.05,^**第页< 0.01对1%O时的EV₂.B。用p2.1、pSV-Renilla和EV、WT PRDX4-V5或PRDX4（C124S）-V5载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001对1%O时的EV₂.C、。用pGalA表达载体、Fluc报告子pG5E1bLuc、Rluc报告子pSV-Renilla和EV、WT PRDX2-V5或PRDX2（C51S）-V5载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001对相同O时的EV₂浓度。D。用pGalA载体、pG5E1bLuc、pSV-Renilla和EV、WT PRDX4-V5或PRDX4（C124S）-V5载体转染HeLa细胞，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001对1%O时的EV₂.

**图8。PRDX2敲除增加HeLa细胞中PRDX4蛋白水平**
HeLa亚克隆暴露于20%或1%O₂用于指示的时间。每个WCL都要用所示抗体进行免疫印迹分析。SC，加扰控制shRNA.P2，PRDX2 shRNA。

**图9。PRDX2和PRDX4抑制HIF靶基因子集的表达**
A。-H。HeLa-shSC和HeLa-sh-PRDX2+4细胞暴露于20%或1%的O₂在强力霉素存在下持续24或72小时。使用针对PRDX2（A）、PRDX4（B）、PDK3（C）、HGF（D）、GPI（E）、SLC2A3（F）、CA9（G）或PGK1（H）mRNA的特异性引物进行逆转录和定量实时PCR（RT-qPCR）分析。每个mRNA的Ct值标准化为18S公司rRNA和所得比率在20%O下进一步标准化为shSC₂每个mRNA的折叠变化显示为平均值±SEM，n个= 3.^***第页< 0.001,^****第页< 0.0001对shSC公司。

**图10。PRDX2和PRDX4阻断HIF-1和HIF-2与靶基因子集的结合**
A。HeLa亚克隆暴露于20%或1%O₂72 h后，使用抗V5抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP），并通过qPCR（平均值±SEM，n个= 3).^*第页< 0.05;^****第页< 0.0001.B。和**C、。**HeLa亚克隆暴露于20%或1%O₂用抗HIF-1α、抗HIF-2α或抗HIF-β抗体进行72 h的ChIP，并用跨HRE的引物qPCR分析DNASLC2A3系列（B）或*PGK1系列*（C）基因（平均值±SEM，n个= 3).^*第页< 0.05,^**第页< 0.01,^***第页< 0.001,^****第页< 0.0001对1%O时的EV₂.

**图11。PRDX2和PRDX4对RNA聚合酶II磷酸化及与HIF靶基因结合的影响**
A。-B。稳定转染EV或编码PRDX2-V5或PRDX4-V5的载体的HeLa细胞暴露于20%或1%的O₂72小时后，使用抗RNA聚合酶II（pSer5）抗体免疫沉淀染色质，并使用跨HRE的引物通过qPCR分析DNASLC2A3系列（A）或*CA9公司*（B）基因（平均值±SEM，n个= 3).

**图12。PRDX2和PRDX4对HIF-1α-p300相互作用的影响**
用空载体（EV）或编码PRDX2-V5或PRDX4-V5的载体转染HeLa细胞，并暴露于1%的O₂对WCL进行IP和抗p300抗体治疗24小时，然后使用HIF-1α、V5和p300抗体进行免疫印迹分析。

**图13。PRDX2表达受HIF-1和HIF-2调节**
A。HeLa细胞暴露于20%或1%的O₂使用针对所示mRNA的特异性引物进行24小时RT-qPCR分析。数据显示为平均值±SEM，n个= 3.^***第页< 0.001对20%O₂.B。HeLa细胞暴露于20%或1%的O₂在指定的时间内。使用PRDX2、HIF-1α、HIF-2α和肌动蛋白抗体对WCL进行免疫印迹分析。通过密度计量化PRDX2和肌动蛋白带，并将其归一化为0 h（20%O₂). 归一化数据显示为平均值±SEM，n个= 3.^*第页< 0.05,^***第页< 0.001对20%氧气。C类HeLa-shSC（SC）、HeLa-sh-HIF-1α（1α）、HeLa-shHIF-2α（2α）和HeLa-sh 1α+2α（DKD）细胞暴露于20%或1%的O₂72小时后，用PRDX2、HIF-1α、HIF-2α和肌动蛋白抗体对WCL进行免疫印迹分析。

**图14。PRDX2是HIF的直接靶基因**
A。人类5′-侧翼区域HIF结合位点（5′-ACGTG-3′以红色显示）的核苷酸序列*PRDX2型*基因（转录起始位点指定为+1）。B。和**C、。**HeLa细胞暴露于20%或1%的O₂用抗HIF-1α（B）、抗HIF-2α（B，n个= 3).^*第页< 0.05,^**第页< 0.01,^***第页< 0.001对20%O₂.D。HeLa细胞与pGL2空载体（EV）、pGL2野生型共转染*PRDX2型*HRE（WT HRE）或pGL2-突变型*PRDX2型*HRE（Mut HRE）和pSV-Renilla，并暴露于20%或1%O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^##第页< 0.01对WT HRE；^***第页< 0.001对企业价值。**E.公司。**HeLa细胞联合转染WT HRE、pSV-Renilla和EV或编码HIF-1α或HIF-2α的载体，并暴露于20%或1%的O₂24小时。Fluc:Rluc活性在20%O下标准化为EV₂（平均值±SEM，n个= 4).^***第页< 0.001对电动汽车；^###第页< 0.001对20%O时的EV₂.

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1. Semenza GL.有氧生活。科学。2007;318:62–64.-公共医学
1. Wang GL，Jiang BH，Rue EA，Semenza GL.低氧诱导因子1是一种受细胞氧张力调节的碱性螺旋-环-螺旋-PAS异二聚体。美国国家科学院院刊1995；92:5510–5514.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Tian H、McKnight SL、Russell DW。内皮PAS域蛋白1（EPAS1），一种在内皮细胞中选择性表达的转录因子。基因开发1997；11:72–82。-公共医学
1. Gu YZ，Moran SM，Hogenesch JB，Wartman L，Bradfield CA。第三α类缺氧诱导因子亚单位HIF3α的分子特征和染色体定位。基因表达。1998;7:205–213.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Ema M、Taya S、Yokotani N、Sogawa K、Matsuda Y、Fujii-Kuriyama Y。一种与低氧诱导因子1α序列相似的新型bHLH-PAS因子调节VEGF的表达，并可能参与肺和血管的发育。美国国家科学院院刊1997；94:4273–4278.-项目管理咨询公司-公共医学

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[4] Wang GL，Jiang BH，Rue EA，Semenza GL.低氧诱导因子1是一种受细胞氧张力调节的碱性螺旋-环-螺旋-PAS异二聚体。美国国家科学院院刊1995；92:5510–5514.-项目管理咨询公司-公共医学

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[8] Gu YZ，Moran SM，Hogenesch JB，Wartman L，Bradfield CA。第三α类缺氧诱导因子亚单位HIF3α的分子特征和染色体定位。基因表达。1998;7:205–213.-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] Ema M、Taya S、Yokotani N、Sogawa K、Matsuda Y、Fujii-Kuriyama Y。一种与低氧诱导因子1α序列相似的新型bHLH-PAS因子调节VEGF的表达，并可能参与肺和血管的发育。美国国家科学院院刊1997；94:4273–4278.-项目管理咨询公司-公共医学

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PRDX2和PRDX4是长时间缺氧条件下低氧诱导因子的负调节因子

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