In Vivo Transplantation of Enteric Neural Crest Cells into Mouse Gut; Engraftment, Functional Integration and Long-Term Safety

doi:10.1371/journal.pone.0147989

。2016年1月29日；11（1）：e014989。

doi:10.1371/journal.pone.0147989。 2016年eCollection。

小鼠肠道神经嵴细胞的体内移植；雕刻、功能集成和长期安全

附属公司

¹干细胞与再生医学，伦敦大学学院儿童健康研究所，英国伦敦吉尔福德街30号。
²比利时鲁汶大学临床和实验医学系胃肠疾病转化研究中心肠神经科学实验室。
^三英国伦敦大学玛丽女王学院巴特斯与伦敦医学与牙科学院Blizard大楼消化疾病中心。
⁴荷兰鹿特丹伊拉斯谟MC大学医学中心临床遗传学系。
⁵英国伦敦大奥蒙德街NHS基金会信托大奥蒙德大街医院消化科。

PMID： 26824433
预防性维修识别码：项目经理4732685
内政部： 10.1371/新闻稿.0147989

小鼠肠道神经嵴细胞的体内移植；雕刻、功能集成和长期安全

朱莉·E·库珀等。公共科学图书馆一号。 2016。

。2016年1月29日；11（1）：e0147989。

doi:10.1371/journal.pone.0147989。 2016年eCollection。

附属公司

¹干细胞与再生医学，伦敦大学学院儿童健康研究所，英国伦敦吉尔福德街30号。
²比利时鲁汶大学临床和实验医学系胃肠疾病转化研究中心肠神经科学实验室。
^三英国伦敦大学玛丽女王学院巴特斯与伦敦医学与牙科学院Blizard大楼消化疾病中心。
⁴荷兰鹿特丹伊拉斯谟MC大学医学中心临床遗传学系。
⁵英国伦敦大奥蒙德街NHS基金会信托大奥蒙德大街医院消化科。

PMID： 26824433
预防性维修识别码：项目经理4732685
内政部： 10.1371/新闻稿.0147989

摘要

目标：肠神经病变是一种严重的胃肠道疾病，其结果并不令人满意。我们的目的是通过将小鼠肠道神经嵴细胞（ENCC）移植到神经节和无神经节小鼠肠道中，并分析功能整合和长期安全性，来研究肠道神经干细胞治疗此类疾病的潜力。

设计：从出生后Wnt1-cre中表达ENCC的黄色荧光蛋白（YFP）产生的神经球；将R26R-YFP/YFP小鼠肠道移植到野生型窝友的神经节后肠或Ednrbtm1Ywa小鼠（缺乏功能性内皮素受体B型）的无神经节后肠道。然后使用免疫组织化学方法评估肠道ENCC的整合和分化，使用钙显像评估细胞功能，使用PCR检测非靶向YFP表达的长期安全性。

结果：YFP+ENCC在受体神经节肠内植入、增殖并分化为肠神经元和胶质细胞。移植细胞及其投射物沿内源性肌间神经丛扩散，形成分支网络。内源性神经纤维的电点刺激导致YFP+移植的ENCCs中的钙瞬变（F/F0=1.16±0.01；43个细胞，n=6）（用TTX消除）。长期随访（24个月）表明，移植的ENCC没有引起肿瘤或扩散到其他器官（肠外部位PCR阴性）。在无神经节细胞的肠道中，ENCC同样扩散和分化，形成神经元和胶质网络，其投射与过渡区的内源性神经网络密切相关。

结论：移植的ENCCs成功植入受体神经节和无神经节肠道，显示出适当的扩散、定位，重要的是，功能整合，没有任何长期安全问题。本研究为肠神经干细胞疗法的开发和应用提供了关键支持。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。出生后Wnt1-cre中YFP+肠神经嵴细胞（ENCC）的分离培养；R26RYFP/YFP小鼠肠道。**
**答：。**流式细胞术剖面图显示YFP+细胞群（绿色）与肠道细胞群（粉红色）分离。B。培养7天后，选定的YFP+细胞形成YFP+神经球。**C、。**免疫组织化学分析证实神经球内所有细胞均表达YFP（绿色；**公民，分部**). 神经球含有神经元标记物TuJ1（红色；**C、 Ci公司**)胶质标记物GFAP（青色；**C、 Cii公司**). DAPI用蓝色标记细胞核（Ciii）**.D。**神经球（用虚线勾勒）也包含表达Sox10（红色；**D、迪**和**第二，**箭头），但GFAP为负值（青色；**D、迪伊**)即假定的ENSSC。插入D类显示了Sox10+/GFAP-细胞（仅红色；星号；推定ENSSC）与Sox10+/GFAP+细胞（红色和青色；推定胶质细胞）相邻的横截面。比例尺输入**B-D公司**=20微米。

**图2。来自移植小鼠神经球的ENCC在受体野生型肠道中表现出适当的定植、定位和类ENS网络的形成。**
**答：。**整个肠道准备显示YFP+移植细胞（绿色）沿着内源性TuJ1+（红色）ENS神经纤维投射。箭头表示移植部位的细胞体，箭头表示移植细胞投射的远端范围。YFP+移植细胞也表达神经元标记物TuJ1，被视为黄色。插图显示了从S1图面板a中的方框区域拍摄的高功率图像，揭示了YFP+细胞体之间的互连和网络形成。B。共焦3D重建显示YFP+移植细胞（绿色）位于移植部位浆膜表面（S）和内环（CM）和外纵（LM）肌层之间的肌间神经丛（MYP；箭头）内。**C、。**YFP+移植细胞（绿色）与突触标记物突触素（红色；箭头）共存。比例尺A类=100μm；C类=25μm。C中的插图显示了各个通道。

**图3。移植的YFP+细胞在宿主肠道内表现出功能整合。**
**答：。**演示在远离YFP+移植细胞的位置对宿主肠神经纤维进行电点刺激的实验方案示意图。**B、 C、。**之前YFP+细胞的代表性图像(B类)以及之后(C类)Fluo4-AM加载。箭头表示移植的神经元（TP细胞）²⁺响应绘制于**（D） ●●●●。D。**显示Ca的代表性痕迹²⁺在控制条件下（实线）和添加TTX（虚线）后，TP电池的响应记录为F/F0。E。证明Ca废除的汇总数据²⁺TTX存在时的反应（43个细胞，n=6）。另请参阅S1电影。

**图4。移植的YFP+小鼠ENCC增殖并生成肠神经元和胶质细胞，但不会扩散到移植的肠道以外。**
A类-**C、。**移植的YFP+细胞共同表达ENS标记（黄色；箭头）的Z投影，包括泛神经标记TuJ1(A类)，抑制性神经元标记物nNOS(B类)和胶质标记物S100(C类). 共表达ENS标记的移植细胞也显示BrdU掺入（青色；箭头；**A-C公司**和插图）。DAPI用蓝色标记细胞核(**A-C公司**和插图）。插图显示单个通道。D。 *Wnt1-cre；r26年*^YFP/YFP表达移植细胞（YFP+）在*r26年*^YFP/YFP受体小鼠通过PCR检测cre转基因的存在。用于鉴定移植小鼠主要器官内cre表达细胞的代表性cre-PCR。脑（B）、肺（Lu）、心（H）、肝（Li）、脾（S）、肾（K）、肾上腺（A）和肠肠系膜（M）的cre均为阴性。对照组织：*Wnt1克；r26年*^YFP/YFP肠道组织（C1）、移植肠道（C2）、YFP+神经球（C3）和*Wnt1-cre；r26年*^YFP/YFP耳部活检（C4）为cre+。比例尺输入**A-C公司**=20微米。

**图5。YFP+ENCC克隆无神经节细胞Ednrb^tm1Ywa公司体内肠道。**
**答：。**Ednrb中的神经元^tm1Ywa公司近节肠TuJ1进展的结肠免疫标记(艾岛)通过部分神经节化过渡区(艾伊)至远端无神经节肠(**Aiii公司**).B。内皮素受体^tm1Ywa公司移植YFP+ENCC（绿色）后3天，可在远端结肠中识别。方框区域是Bi中放大的区域，星号表示该区域的假定移植部位。**Bi公司**从移植部位扩散的移植细胞之间可以看到相互连接。**比伊。**内源性神经元表达神经元标记Tuj1（红色；箭头）和YFP+移植细胞（绿色）的Z投影也与Tuj1共存（黄色；箭头）。YFP+预测；移植的Tuj1+细胞与过渡区内的内源性Tuj1＋神经元的投射密切相关（插图**Bii；**分别为箭头和箭头）。比例尺输入**Bi公司**=100μm；**Bii公司**=50微米。DAPi以蓝色显示。

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