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.2015年11月1日；1（6）:646-663.e4。
doi:10.1016/j.jcmgh.2015.07.007。

脂质诱导的肝细胞源性细胞外囊泡通过靶向PPAR-γ的microRNAs调节肝星状细胞

大卫·波维罗 1, 纳迪娅·帕内拉 2, 江口明子 1, 凯西·约翰逊 1, 贝蒂娜·帕普查多 三, 卢卡斯·德·阿劳霍尔·霍塞尔（Lucas de Araujo Horcel） 4, 伊娃·M·皮纳特 5, 安娜·阿利西 2, 瓦莱里奥·诺比利 2, 阿里尔·费尔德斯坦 1
附属公司

脂质诱导的肝细胞源性细胞外囊泡通过靶向PPAR-γ的microRNAs调节肝星状细胞

大卫·波维罗等。 细胞分子胃肠肝素. .

摘要

背景和目标：肝星状细胞（HSC）在包括非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在内的各种慢性肝病的肝纤维化中起着关键作用。肝纤维化的发展需要从静止的HSC转变为激活的HSC。NAFLD中HSC激活的触发因素尚不清楚。我们研究了脂肪毒性期间肝细胞释放的细胞外小泡（EVs）在HSC表型调节中的作用和分子机制。

方法：通过差速离心从脂肪肝细胞中分离EV并与HSC孵育。评估EV内化和HSC激活、迁移和增殖。进行了功能丧失和获得研究，以探讨EV携带的PPAR-γ靶向miRNAs进入HSC的潜在作用。

结果：脂肪毒性期间释放的肝细胞衍生EV被HSC有效内化，导致其活化，如促纤维化基因（胶原蛋白-I、α-SMA和TIMP-2）、增殖、趋化性和伤口愈合反应的显著上调所示。这些变化与EV穿梭的miRNAs和HSC中PPAR-γ表达的抑制有关。肝细胞衍生EVs miRNA含量包括各种miRNA，这些miRNA是已知的PPAR-γ表达抑制剂，其中miR-128-3p是最有效的转移物。此外，功能丧失和获得研究确定miR-128-3p是EVs对PPAR-γ抑制和HSC激活作用的中心调节剂。

结论：我们的研究结果证明了脂肪肝细胞衍生EV与肝纤维化之间的联系，并对NAFLD和其他纤维化疾病新的抗纤维化靶点的开发具有潜在意义。

关键词：细胞外囊泡；肝星状细胞；脂毒性；肝纤维化；miRNA。

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利益冲突声明

无

数字

补充图1
补充图1
针对GAPDH的对照中和抗体不影响细胞外囊泡（EV）内化或EV诱导的肝星状细胞（HSC）激活。(A类)肝细胞衍生的PKH26阳性细胞外囊泡（EV，红色）在与GAPDH中和抗体（GAPDH nAb）孵育的EV孵育6小时后内化为LX2和原代小鼠HSC（F-actin纤维，绿色和细胞核，DAPI）的典型显微照片。(B类)用HepG2衍生的EVs（Hep-MP）处理的人永生化HSC（LX2）和用GAPDH nAb孵育16小时的EVs中PPAR-γ的定量PCR分析。(C类)定量PCR分析用甘油醛-3-磷酸脱氢酶中和抗体（GAPDH-nAb）孵育16小时的Hep-EV和EV处理的LX2中的促纤维化基因α-SMA、胶原蛋白1型和TIMP-2。以β2-微球蛋白为对照。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P） < .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
补充图2
补充图2
从小鼠原代肝细胞分离出的胞外小泡（EVs），与静止的小鼠原代肝脏星状细胞（HSC）孵育。(A类)暴露于0.25μM棕榈酸24小时的原代小鼠肝细胞的典型显微照片。(B类)流式细胞术分析从棕榈酸处理或载体处理的小鼠原代肝细胞中分离的钙黄绿素+EV的数量。(C类)第一天（静止HSC）到第七天（激活HSC）体外培养的原代小鼠HSC的代表性显微照片。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
补充图3
补充图3
用miR-128-3p模拟物或拮抗剂miR-128-3p转染的肝星状细胞（HSC）中PPAR-γmRNA的表达时间过程和miR-128-3p水平。(A类)定量聚合酶链反应（qPCR）分析暴露于HepG2衍生细胞外囊泡（EVs）或对照组3、6、16或24小时的LX2过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）的时间进程。使用Vanin-1中和抗体（VNN1-nAb）阻止EV内化。(B类)转染MiR-128-3p MIMIC或暴露于EV和对照组16小时的LX2中的MiR-128-3p水平。(C类)用AntagomiR-128-3p转染或暴露于EV和对照16小时的LX2中的MiR-128-3p水平。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图1
图1
肝细胞衍生的细胞外囊泡（EV）内化到肝星状细胞（HSC）中，诱导促纤维化标记物上调。(A类)用PKH26标记的HepG2衍生细胞外囊泡（HepG2-EV）和原代小鼠肝细胞EVs（PMH-EVs）内化为永生化人肝星状细胞（LX2）和原发小鼠肝星状上皮细胞（mHSC）与EVs孵育6小时后通过间接免疫荧光进行评估，并通过40倍放大的共焦显微镜成像。使用Vanin-1中和抗体（VNN1-nAb）阻止EV内化。(B类)定量聚合酶链反应分析LX2中的促纤维化基因α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原蛋白1型和金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2），暴露于Hep-EV 16小时，有或没有Vanin-1中和抗体。(C类)Western blot分析暴露于Hep-EVs 24小时的LX2中HSC活化α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β（转化生长因子-β）、（结缔组织生长因子）CTGF和（胶质纤维酸性蛋白）GFAP标记物，包括或不包括VNN1-nAb。(天)定量α-SMA和CTGF蛋白水平归一化为肌动蛋白。(电子)定量qRT-PCR分析原代小鼠肝星状细胞（mHSC）中促纤维化基因α-SMA和1型胶原对PMH-EVs 16小时的作用，包括或不包括VNN1-nAb。β2-微球蛋白（B2M）作为qRT-PCR的看家基因，肌动蛋白和微管蛋白作为Western blotting的负荷对照。数值代表三个独立实验的平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图2
图2
肝细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）可诱导肝星状细胞的迁移、创伤愈合反应和增殖。(A类)代表性显微照片（10倍放大）和(B类)暴露于HepG2衍生EVs（Hep-EV）16小时的人类永生化肝星状细胞（LX2）的Boyden腔分析的相应量化直方图。(C类)代表性的显微照片和(天)经Hep-EV处理24小时的LX2伤口愈合试验的相应量化图。(电子)经Hep-EV治疗48小时的LX2增殖试验定量图。使用Vanin-1中和抗体阻止Hep-EV的内化。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图3
图3
肝细胞衍生的细胞外小泡（EVs）通过穿梭特异性microRNA下调过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）。(A类)定量聚合酶链反应（qPCR）分析用HepG2衍生EVs（Hep-EVs）处理16小时的人永生化肝星状细胞（LX2）中的PPAR-γ，包括或不包括Vanin-1中和抗体（VNN1-nAb）。(B类)在存在或不存在VNN1 nAb的情况下，用Hep-EV处理24小时的LX2中PPAR-γ蛋白水平的Western blot分析。(C类)用含或不含VNN1 nAb的原代小鼠肝细胞衍生EVs（PMH-EVs）处理16小时的原代小鼠肝星状细胞（mHSCs）中PPAR-γ的定量PCR分析。β2-微球蛋白（B2M）作为看家基因进行定量PCR，肌动蛋白作为Western blotting的负荷对照。(天)PKH26阳性Hep-EV内化的典型共焦显微照片（60倍放大）(红色)和用SYTO RNA标记的EV-RNA含量(绿色). (电子)用Hep-EVs治疗LX2 16小时，加或不加VNN1-nAb，对靶向miR-128-3p、miR-27b和miR-130b的PPAR-γ进行定量PCR。(F类)用0.25μM棕榈酸或载体处理24小时后，从HepG2分离的EV中定量PCR分析miR-128-3p。(G公司)对（mHSC）中PPAR-γ靶向miR-128-3p进行定量PCR，用Hep-EVs处理16小时，加或不加VNN1-nAb。(H（H）)定量PCR分析从经0.25μM棕榈酸或载体处理24小时的PMH-EVs中分离的EVs中的miR-128-3p。对照组为U6。数值代表三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）<.05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图4
图4
将肝星状细胞（HSC）人工暴露于miR-128-3p模拟物中，显示出由HepG2衍生细胞外囊泡（Hep-EVs）穿梭的miR-128-3 p诱导的类似促纤维化反应。(A类)HSC中获得功能方法的图形总结。(B类)定量聚合酶链反应（qPCR）分析用HepG2-EV、miR-128-3p模拟物或阴性对照模拟物处理16小时的人类永生化肝星状细胞（LX2）过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）。(C类)HepG2-EV、miR-128-3p模拟物或阴性对照模拟物处理24小时的LX2中PPAR-γ蛋白水平的Western blot分析。(天)定量PCR分析经HepG2-EV、miR-128-3p模拟物或阴性对照模拟物处理16小时的LX2中促纤维化基因α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原。β2-微球蛋白（B2M）作为qPCR的看家基因，肌动蛋白作为Western blotting的负荷对照。(电子)暴露于HepG2-EV、miR-128-3p模拟物或阴性对照模拟物48小时后，5-溴-2-脱氧尿苷阳性LX2的增殖试验。(F类)代表性的显微照片和(G公司)与HepG2-EV、miR-128-3p模拟物和阴性对照模拟物孵育16小时的LX2博伊登室试验的相应量化图。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图5
图5
肝星状细胞（HSC）中miR-128-3p功能的丧失挽救了PPAR-γ的表达，降低了活化、迁移和增殖。(A类)肝星状细胞（HSC）功能丧失途径的图示总结。(B类)定量聚合酶链反应（qPCR）分析用HepG2衍生细胞外囊泡（Hep-EVs）、AntagomiR-128-3p或抗对照处理16小时的人类永生化肝星状细胞（LX2）中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）。(C类)Western blot分析经Hep-EVs、antagomiR-128-3p或抗对照治疗24小时的LX2中PPAR-γ蛋白水平。(天)定量聚合酶链反应（qPCR）分析经Hep-EVs、antagomiR-128-3p或抗对照治疗16小时的LX2中促纤维化基因α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原。β2-微球蛋白（B2M）作为管家基因进行定量PCR，肌动蛋白作为负载对照进行蛋白质印迹。(电子)暴露于Hep-EVs、AntagomiR-128-3p或抗对照药48小时后，5-溴-2-脱氧尿苷阳性LX2的增殖试验。(F类)代表性的显微照片和(G公司)与Hep-EVs、AntagomiR-128-3p或抗对照孵育16小时的LX2的Boyden室分析的相应量化图。数值代表三个独立实验的平均值±标准差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图6
图6
HepG2中microRNA机制的耗竭导致HepG2-衍生的细胞外囊泡（Hep-EV）减少对HSC的促纤维化作用。(A类)HepG2中Dicer/Drosha双沉默以产生脂肪毒性期间miRNA-reduced EVs的图形总结。(B类)定量PCR分析经Dcr/Dro沉默RNA（siRNA）或干扰RNA（scRNA）处理48小时并暴露于0.25μM棕榈酸或载体24小时以释放EV的HepG2中的Dicer1（Dcr）和Drosha（Dro）。(C类)用或不用沉默RNA（siRNA）和扰乱RNA（scRNA）处理72小时的HepG2中Dicer的蛋白质印迹分析。β2-微球蛋白（B2M）作为看家基因用于定量聚合酶链反应（PCR），肌动蛋白作为负荷对照用于Western blot分析。(天)定量PCR分析经Dcr/Dro siRNA或scRNA处理的HepG2释放的Hep-EV中miR-128-3p的数量(电子)暴露于从棕榈酸处理过的HepG2、scRNA-处理过的HepG2和Dcr/Dro siRNA-治疗过的Hep G2（Dcr/Dro-）中分离出的EV中的5-溴-2-脱氧尿苷阳性LX2的增殖试验，随后暴露于棕榈酸。(F类)代表性的显微照片和(G公司)暴露于来自棕榈酸处理的HepG2、scRNA-处理的Hep G2和Dcr/Dro siRNA-治疗的HepG2（Dcr/Dro-）的EV的LX2的Boyden小室分析的相应量化直方图，然后是plamitic acid暴露。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图7
图7
HepG2衍生细胞外囊泡（Hep-EVs）中miR-128-3p的特异性缺失显著降低了肝星状细胞（HSC）的促纤维化反应。(A类)用于抑制棕榈酸处理的HepG2中miR-128-3p并生成缺失miR-128-3 p的EV的方法的图形摘要。(B类)定量聚合酶链反应（qPCR）分析经antagomiR-128-3p或抗对照转染并暴露于0.25 mM棕榈酸的HepG2中miR-128-3p的表达。(C类)定量PCR分析转染抗对照和antagomiR-128-3p的HepG2释放的Hep-EV中miR-128-3p的水平。平均值归一化为U6小核RNA(天)定量PCR分析促纤维化基因α-SMA、TIMP-1和胶原蛋白1α1的表达，以及HSC静止标记物PPAR-γ在LX2中的表达，LX2用miR-128-3p缺失的Hep-EV、Hep-EV或从抗对照转染的HepG2分离的Hep-EV处理。β2-微球蛋白（B2m）作为看家基因。(电子)暴露于从抗对照转染的HepG2分离的miR-128-3p缺失的Hep-EV、Hep-EV或Hep-EV48小时后，5-溴-2-脱氧尿苷阳性LX2的增殖试验。(F类)代表性的显微照片和(G公司)与miR-128-3p缺失的Hep-EV、Hep-EV或从抗对照转染的HepG2中分离的Hep-EV孵育16小时的LX2的Boyden室分析的相应量化图。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<.0005，Kruskal-Wallis检验与事后Mann-Whitney检验和Bonferroni校正。
图8
图8
饮食诱导非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）/非酒精性肝炎（NASH）两种实验模型中肝脏miR-128-3p的上调。(A类)由训练有素的病理学家以盲法分析H&E肝脏标本的脂肪变性、炎症和膨胀，确定喂食高脂肪、补充胆碱的小鼠的NAFLD活性评分分析评分我-氨基酸（CSAA）或胆碱缺乏我-氨基酸（CDAA）。(B类)从喂食高脂肪饮食12周、CSAA或CDAA饮食20周或正常饮食的小鼠肝标本中采集的H&E染色的代表性显微照片。(C类)miR-128-3p在喂食高脂饮食12周、CSAA或CDAA饮食20周或正常饮食的小鼠肝脏样本中的表达水平。平均值归一化为U6小核RNA。值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）＜0.005***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。
图9
图9
肝细胞衍生的细胞外囊泡（EV）在脂肪毒性过程中释放，并诱导从静止到活化的肝星状细胞（HSC）的表型转换。在肝脏脂肪变性期间，游离脂肪酸在肝细胞中积累，导致脂质诱导毒性（脂毒性）和细胞死亡。濒死的肝细胞产生并释放EV，EV携带多种不同的生物活性分子，尤其是miR-128-3p等微小RNA，后者在脂肪肝细胞中高度上调。EVs将miR-128-3p穿梭到HSC中，导致过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）受到抑制，从而导致HSC从静止状态转变为激活状态。选择性抑制miR-128-3p可挽救PPAR-γ的表达并导致HSC失活。
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