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.2016年3月1日；76(5):1031-43.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-2001。 Epub 2015年12月16日。

诱导头颈癌PD-L1表达的EGFR和IFNγ下游细胞内和外途径的鉴定

费尔南多·康查-贝纳文特 1, 拉格文德拉·M·斯利瓦斯塔瓦 2, 苏米塔·特里维迪 2, 于磊 三, 乌玛·钱德兰 4, 拉贾·塞塔拉 5, 戈登·弗里曼 6, 罗伯特·L·费里斯 7
附属公司

诱导头颈癌PD-L1表达的EGFR和IFNγ下游细胞内和外途径的鉴定

费尔南多·康查-贝纳文特等。 癌症研究. .

摘要

许多癌症类型，包括头颈癌（HNC），表达程序性死亡配体1（PD-L1）。PD-L1及其受体程序性死亡1（PD-1）之间的相互作用抑制激活的T细胞的功能，并导致免疫抑制微环境，但诱导PD-L1表达的刺激没有很好的特征。干扰素γ（IFNγ）和表皮生长因子受体（EGFR）分别利用Janus激酶2（JAK2）作为共同的信号节点来传递肿瘤细胞介导的外源性或内源性信号。在这项研究中，我们研究了这些因子在JAK/STAT通路激活、Th1炎症和HPV状态下上调HNC细胞中PD-L1表达的机制。我们发现，在大量HNC标本中，野生型、过度表达的EGFR与JAK2和PD-L1的表达显著相关。此外，PD-L1的表达是以EGFR-和JAK2/STAT1依赖的方式诱导的，特异性JAK2抑制可阻止肿瘤细胞中PD-L1上调并增强其免疫原性。总之，我们的研究结果表明JAK2/STAT1在EGFR-介导的免疫逃逸中具有新的作用，针对该信号轴的治疗可能有助于阻断在大部分HNC肿瘤中发现的PD-L1上调。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突：Robert L.Ferris获得了百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb）和AZ/Medimune的研究资助，并曾担任Celgene、默克（Merck）、BMS和AZ-Medimune公司的顾问/顾问委员会成员。Gordon J.Freeman报告称拥有默克、百时美施贵宝、罗氏、EMD Serono、Amplimmune、Boehringer Ingelheim和诺华的所有权（包括专利），以及诺华、罗氏和BMS、礼来和表面肿瘤学的顾问/顾问。

数字

图1
图1。HPV中PD-L1蛋白表达较高+肿瘤标本
答：。PD-L1蛋白在HNC肿瘤标本中的表达（IHC，n=134）。当肿瘤染色阈值高于5%时，认为PD-L1阳性。59.7%的肿瘤为PD-L1+.B。HPV中PD-L1的表达−和HPV+肿瘤标本采用与A.70%HPV相同的标准+HPV为43.3%−样本为PD-L1+ C类PD-L1百分比+HPV肿瘤面积−和人乳头瘤病毒+试样。虚线代表5%的肿瘤阳性，实线代表中位数。（Mann-Whitney，**P<0.001）。D。代表性高强度，100%PD-L1+，HPV+肿瘤。E.公司。代表性低强度，50%PD-L1+人乳头瘤病毒−肿瘤。左边的插图表示右边的放大倍数（20倍）。F、。HNSCC细胞表达不同水平的PD-L1。
图2
图2。人乳头瘤病毒+标本显示Th1型RNA表达谱较高，PD-L1的表达与JAK2、EGFR和IFNγ的表达相关，与HPV状态无关
A类表达为PD-L1、PD-1、CD8A、CD8B、IFNγ、JAK2、JAK1、STAT1、EGFR、PIK3CA、TORC1、4EBP1和MAPK1（66 HPV）的RSEM单位的RNAseq表达热图−和22 HPV+)TCGA数据库（35），红色方框强调HPV中Th1基因的高表达+人乳头状瘤病毒中EGFR的高表达−对应物（颜色代码，黄色比黑色高10倍，绿松石色比黑色低10倍）。B。人乳头瘤病毒+肿瘤标本显示Th1型表达谱（PD-1、CD8A、IFNγ和JAK2）显著升高。EGFR在HPV中的表达显著增高−肿瘤标本（Mann-Whitney*P<0.05，**P<0.001）。C、。在两种HPV中PD-L1表达与JAK2显著相关−和HPV+样本（皮尔逊r和线性回归曲线拟合，***p<0.0001）。D。HNC标本相邻切片和匹配区域的PD-L1和pJAK2 IHC染色。PD-L1（顶面板）主要在肿瘤细胞膜上表达。Phospho-JAK2（底图）显示出强烈的核染色，偶尔出现弱-中度细胞质染色。PD-L1阳性肿瘤岛对磷酸化JAK2也呈弥漫性强阳性（23个样本中有3个具有代表性）E.公司。PD-L1 mRNA表达与两种HPV的EGFR显著相关−和人乳头瘤病毒+样本（皮尔逊r和线性回归曲线拟合*P<0.05**P<0.001）。F、。PD-L1 mRNA表达与IFNγ显著相关，与HPV状态无关（Pearson r和线性回归曲线拟合***P<0.0001）。66人乳头瘤病毒−和22 HPV+从TCGA数据库收集的肿瘤标本。
图3
图3。STAT1，而不是STAT3、PI3KCA或MAPK1在肿瘤组织中的表达较高，并且与PD-L1、EGFR和IFNγ的表达密切相关，而与HPV状态无关
答：。与匹配的对照粘膜相比，肿瘤标本中STAT1而非STAT3、PIK3CA或MAPK1的表达显著增高（TCGA、46例HNC肿瘤标本和匹配的对照，Mann-Whitney，***P<0.0001）。B。STAT1表达与PD-L1无再生HPV状态密切相关（Pearson r和线性回归曲线拟合，**P＜0.001***P＜0.0001）C、。PD-L1型+肿瘤岛在HNC标本中STAT1蛋白也呈强阳性。HNC样本的代表性切片共染PD-L1（棕色色原）和STAT1（红色色原）。插图表示肿瘤区域放大，黄色圆圈表示共定位。D–E型STAT1表达与EGFR和IFNγ表达相关，与HPV状态无关。（皮尔逊r和线性回归曲线拟合，**P<0.001***P<0.0001）。
图4
图4。IFNγ介导的PD-L1上调依赖JAK2/STAT1
答：。JAK2抑制剂BMS-911345（JAK2i）可消除IFNγ介导的PD-L1蛋白上调，而与HPV状态无关。用溶媒对照、JAK2i（10uM）、IFNγ（10IU/mL）或两者联合处理HNSCC细胞48h，收获后用流式细胞术（FC）检测PD-L1的表达B。JAK2i消除IFNγ介导的PD-L1 mRNA上调。细胞株用载体对照、IFNγ（10IU/mL）或JAK2i（10uM）或两者联合处理24h；通过qPCR测定PD-L1 mRNA，并将其表达为载体的倍数变化C、。JAK1/3抑制不能阻止IFNγ介导的PD-L1上调。处理细胞株JAK1/3i（10uM）、JAK2i（10uM）、IFNγ（10IU/mL）或联合处理48h，通过FC测定PD-L1的表达（方差分析，ns=不显著）D类IFNα没有上调PD-L1的表达。细胞与干扰素α（1000 IU/mL）、JAK2i（10uM）和两者的组合培养48小时。干扰素γ（10IU/mL）用作阳性对照。PD-L1表达由FC测定（ANOVA，ns=不显著）。E.公司。当STAT1而非STAT3沉默时，IFNγ介导的PD-L1上调被废除。用STAT1 siRNA、STAT3 siRNA或对照siRNA（10nM）培养细胞48小时，然后不处理或用IFNγ（10IU/mL）处理额外48小时，收获细胞，并用FC测定PD-L1的表达。F、。经干扰素γ处理后，pSTAT1而非pSTAT3与PD-L1启动子区域结合，如ChIP分析所示。细胞未经处理或用IFNγ（10IU/mL）或IFNγ+西妥昔单抗处理30分钟，ChIP分析显示PD-L1启动子中pSTAT1富集（黑条）。PD-L1富集度以输入DNA的百分比计算（参考材料和方法）（方差分析*P<0.05，**P<0.01）。G.公司。西妥昔单抗介导的EGFR阻断下调IFNγ介导的PD-L1 mRNA上调。细胞系用载体、IFNγ（10IU/mL）、西妥昔单抗（10ug/mL）或IFNγ+西妥昔单抗处理24 h，收获后用qPCR定量mRNA，并以载体的倍数变化表示（方差分析，*P<0.05，***P<0.0001）H。西妥昔单抗介导的EGFR阻断下调了IFNγ介导的PD-L1蛋白的上调。将细胞系作为G处理48小时，然后通过FC测定PD-L1蛋白的表达（ANOVA，***P<0.0001）
图5
图5。EGFR-介导的PD-L1上调依赖于JAK2/STAT1
答：。EGF上调PD-L1蛋白表达。细胞未经处理或用EGF（10ng/mL）处理48h，IFNγ（10IU/mL）作为阳性对照。收集细胞，通过FC测定PD-L1表面表达B。EGF治疗可上调PD-L1 mRNA的表达。细胞被视为A类在24小时内，通过qPCR测定收获物和PD-L1 mRNA的表达，并表示为与载体对照组相比的折叠变化（ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。C、。JAK2而不是JAK1/3抑制下调PD-L1的基线表达。用JAK1/3抑制剂（JAK1/3i，10uM）或JAK2i（10uM。D。JAK2而非JAK1/3抑制可阻止EGF介导的PD-L1上调。用JAK1/3i（10uM）或JAK2i（10u M）处理细胞48小时，通过FC测定PD-L1表达水平（ANOVA，ns=无显著性**P<0.001**P<000001）。E.公司。EGF诱导pSTAT1y701上调。用EGF（10ng/mL）处理细胞1、2、4、24和48小时，收获、固定和渗透，用ICF测定pSTAT1y701或总STAT1的表达。F、。STAT1沉默可防止EGF诱导的PD-L1上调。用对照siRNA或STAT1 siRNA（10nM）和EGF（10ng/mL）处理细胞48h，收获细胞并用FC测定PD-L1表达（ANOVA，***P<0.001）。
图6
图6。抑制JAK2可防止NK介导的PD-L1对肿瘤细胞的上调并增强西妥昔单抗介导的NK细胞的细胞毒性
答：。当与西妥昔单抗激活的NK细胞以IFNγ依赖性方式共同培养时，肿瘤细胞PD-L1表达上调（左面板，开条）。肿瘤靶点的JAK2i预处理阻止了PD-L1的上调（左图，闭合条）。相反，在相同条件下（右侧面板，封闭栏），JAK1/3抑制并不能阻止PD-L1上调。肿瘤靶细胞在单独培养基或添加JAK2i（10uM）的培养基中培养48小时，然后与NK细胞共同培养24小时，无论是单独培养还是在西妥昔单抗（10ug/mL）、帕尼单单抗（10 ug/mL。具有相似结果的两个独立实验的数据表示B。较高的NK-cetuximab介导的JAK2i预处理靶点的裂解（闭合黑条，5:1和20:1效应器：靶点比率）。用JAK2i（10uM）预处理肿瘤细胞48小时，然后用51Cr与纯化NK细胞+培养基、IgG1对照组（10ug/mL）或西妥昔单抗（10ug/mL）共培养4h（ANOVA，*P<0.05，***P<0.0001）。
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