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.2016年1月5日；7(1):81-93.
doi:10.18632/目标6447。

MicroRNA-17-5p激活的Wnt/β-catenin通路参与肝纤维化的进展

于福君 1, 中秋路 2, 凯特·黄 三, 王晓东 1, 徐自强 4, 陈必成 5, 裴洪东 1, 郑建坚 5
附属公司

MicroRNA-17-5p激活的Wnt/β-catenin通路参与肝纤维化的进展

于福君等。 Oncotarget公司. .

摘要

Wnt/β-catenin通路异常参与了肝纤维化的发展。微RNA（MiRNAs）被发现在肝纤维化中作为肝星状细胞（HSC）激活的调节器。然而，在肝纤维化过程中，miRNA是否激活活化的HSC中的Wnt/β-catenin通路在很大程度上是未知的。在本研究中，我们发现丹酚酸B（Sal B）治疗显著抑制CCl4治疗大鼠、HSC-T6细胞和大鼠原代HSC的肝纤维化，从而抑制I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白。此外，Sal B在体外抑制HSC活化和细胞增殖。有趣的是，Sal B治疗诱导Wnt/β-catenin途径失活，同时Pβ-catening和Wnt抑制因子1（WIF1）增加。我们证明，Sal B引起的抗纤维化作用至少部分通过WIF1。此外，我们的研究表明，Sal B治疗后体内外miR-17-5p降低。荧光素酶活性测定证实，WIF1是miR-17-5p的直接靶点。值得注意的是，Sal B诱导的HSC抑制几乎被miR-17-5p模拟物抑制。总之，我们证明miR-17-5p通过抑制WIF1的表达激活Wnt/β-catenin通路，从而导致HSC激活。

关键词：病理科；丹酚酸B；Wnt抑制因子1（WIF1）；Wnt/β-catenin途径；肝星状细胞；microRNA-17-5p。

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数字

图1
图1。Sal B显著改善CCl4-大鼠诱导性肝纤维化
答：。H&E染色（×100）和Masson染色（×10 0）评估肝纤维化。B。用免疫组织化学方法分析CCl中α-SMA的水平4-Sal B治疗后的大鼠。展示了每组的代表性视图（原始放大倍数×10）。C、。检测CCl中α-SMA、I型胶原和WIF1 mRNA水平4-Sal B治疗后的大鼠。D。检测CCl中α-SMA、I型胶原、P-β-catenin和WIF1的蛋白水平4-Sal B治疗后的大鼠。GAPDH被用作内部控制。每个值是三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组和#P（P）与CCl相比<0.054组。
图2
图2。WIF1在Sal B抗纤维化作用中的作用
用WIF1 siRNA转染HSC-T6细胞和原代HSC 48小时和/或用Sal B处理48小时。答：。实时PCR分析WIF1的mRNA表达。B。western blotting分析WIF1的蛋白表达。GAPDH被用作内部控制。C、。WIF1 siRNA恢复Sal B降低的TCF活性。D。WIF1 siRNA阻断了Sal B诱导的α-SMA和Col1A1 mRNA水平的降低。E.公司。WIF1 siRNA减弱Sal B对α-SMA、I型胶原和P-β-catenin蛋白水平的影响，GAPDH作为内部对照。F、。WIF1 siRNA抑制Sal B诱导的细胞增殖减少。每个值是三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组和#P（P）与Sal B组相比，<0.05。
图3
图3。miR-17-5p过度表达促进HSC的激活，并有助于WIF1水平的降低
用miR-17-5p模拟物或miR-NC转染HSC-T6细胞和原代HSC 48小时。答：。在CCl中发现miR-17-5p表达下调4-Sal B治疗后的大鼠、HSC-T6细胞和原代HSC。B。通过共聚焦激光显微镜评估α-SMA（红色）和结蛋白（绿色）的免疫荧光染色。DAPI染色细胞核呈蓝色。比例尺，50μm。C、。通过实时PCR分析经miR-17-5p模拟物处理的HSC中WIF1的mRNA表达。D。通过western blotting分析经miR-17-5p模拟物处理的HSC中WIF1的蛋白表达。GAPDH被用作内部控制。E.公司。WIF1 siRNA对转染miR-17-5p抑制剂的HSC细胞周期的影响。将miR-17-5p抑制剂转染原代HSC 48 h，然后再转染WIF1 siRNA 48 h。每个值为三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组或miR-NC相比，<0.05。#P（P）与miR-17-5p抑制剂组相比，<0.05。
图4
图4。MiR-17-5p抑制剂治疗显著抑制CCl引起的大鼠肝纤维化4
答：。H&E染色（×100）和Masson染色（×10 0）评估肝纤维化。B。用免疫组织化学方法分析CCl中α-SMA的水平4-miR-17-5p抑制剂治疗后的大鼠。展示了每组的代表性视图（原始放大倍数×10）。每个值是三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组和#P（P）与CCl相比<0.054组。
图5
图5。miR-17-5p与WIF1的3′UTR的相互作用
答：。WIF1 mRNA 3′UTR中miRNA结合位点的示意图microRNA.org网站黑框表示miR-17-5p，测试序列表示插入荧光素酶报告载体的区域。B。预测靶区和miR-17-5p的相应配对。根据配对位点，相应的荧光素酶报告载体命名为pMIR-17-5p和pMIR-17%-5p-Mut。C、。用pMIR（空载体）、含有miR-17-5p靶序列的pMIR和带有miR-17-5 p突变靶序列的p miR转染HSC。该图显示了转染pMIR-17-5p或pMIR-17.5p-Mut的细胞中的荧光素酶活性。它还显示miR-17-5p前体或miR-NC的共转染*P（P）< 0.05.
图6
图6。miR-17-5p在Sal B抗纤维化作用中的作用
用miR-17-5p模拟物转染HSC-T6细胞和原代HSC 48小时，并用Sal B再处理48小时。答：。实时荧光定量PCR分析WIF1、α-SMA和Col1A1的mRNA表达。B。western印迹分析WIF1、α-SMA、I型胶原和P-β-连环蛋白的蛋白表达。GAPDH被用作内部控制。C、。miR-17-5p模拟物恢复了Sal B诱导的TCF活性降低。D。miR-17-5p模拟物恢复了Sal B诱导的细胞增殖减少。每个值是三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组和#P（P）与Sal B组相比，<0.05。
图7
图7。Sal B治疗后激活的HSC中发现了信号通路
Sal B诱导miR-17-5p下调，WIF1上调，Wnt通路失活，从而抑制活化的HSC。
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