Interleukin-6 suppression reduces tumour self-seeding by circulating tumour cells in a human osteosarcoma nude mouse model

doi:10.18632/oncotarget.6371

.2016年1月5日；7(1):446-58.

doi:10.18632/oncotarget.6371。

白细胞介素-6抑制通过在人骨肉瘤裸鼠模型中循环肿瘤细胞减少肿瘤自接种

张英龙¹, 琼马¹, 刘涛（Tao Liu）¹, 关国锋², 张凯亮^三, 陈佳彦⁴, 楠佳¹, 石咀岩¹, 陈观音¹, 刘士伦¹, 郭江¹, 姚璐¹, 温燕华¹, 赵海恩（Haien Zhao）¹, Yong Zhou（永州）¹, 清羽扇¹, 邱秀春¹

附属机构

¹第四军医大学唐都医院骨科肿瘤研究所，陕西西安。
²滨州医科大学附属医院显微外科，山东滨州。
^三中国山东省泰安市解放军第88医院骨科。
⁴第四军医大学公共卫生学院职业与环境卫生系，陕西西安。

PMID： 26623559
预防性维修识别码： 2010年8月4日
内政部： 10.18632/目标6371

白细胞介素-6抑制通过在人骨肉瘤裸鼠模型中循环肿瘤细胞减少肿瘤自接种

张英龙等。 Oncotarget公司. 2016.

.2016年1月5日；7(1):446-58.

doi:10.18632/目标6371。

作者

张英龙¹, 琼马¹, 刘涛（Tao Liu）¹, 关国锋², 张开良^三, 陈佳彦⁴, 楠佳¹, 石咀岩¹, 陈观音¹, 刘士伦¹, 郭江¹, 姚璐¹, 温燕华¹, 赵海恩（Haien Zhao）¹, Yong Zhou（永州）¹, 清羽扇¹, 邱秀春¹

附属机构

¹中国陕西省西安市第四军医大学唐都医院肿瘤骨科研究所。
²滨州医科大学附属医院显微外科，山东滨州。
^三中国山东省泰安市解放军第88医院骨科。
⁴第四军医大学公共卫生学院职业与环境卫生系，陕西西安。

PMID： 26623559
预防性维修识别码：项目经理4808010
内政部： 10.18632/目标6371

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）的肿瘤自接种可促进肿瘤的进展和复发。之前，我们证明了CTC的肿瘤自接种发生在骨肉瘤中，并揭示了白细胞介素-6（IL-6）可能促进CTC的吸引。在这里，我们研究了IL-6在CTC自我接种肿瘤中的潜在机制。IL-6抑制抑制体外细胞增殖、迁移和侵袭。此外，rhIL-6在体外激活了Janus激活的激酶/信号转导子和转录激活子3（JAK/STAT3）和有丝分裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2（MAPK/ERK1/2）通路。这两种途径都促进细胞增殖，但只有JAK/STAT3途径促进迁移。抑制IL-6抑制体内肿瘤生长和转移。IL-6抑制或JAK/STAT3通路抑制减少了原发性肿瘤中CTC的播散。总之，IL-6促进CTC在裸鼠模型中的肿瘤自接种。这一发现可能为未来预防骨肉瘤进展和复发的治疗干预提供一种新的策略。

关键词：白细胞介素-6；转移；骨肉瘤；复发；通过循环肿瘤细胞进行肿瘤自接种。

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提交人声明，不存在利益冲突。

数字

**图1。骨肉瘤细胞中IL-6的表达及shRNA介导的抑制**
a。免疫细胞化学检测IL-6在SOSP-9607、F5M2和F4骨肉瘤细胞和对照hFOB1.19正常人成骨细胞中的表达（200×）。b。Western blotting显示IL-6蛋白在SOSP-9607、F5M2和F4人骨肉瘤细胞和对照hFOB1.19正常人成骨细胞中的表达。c。ImageJ软件分析的相对IL-6蛋白表达水平。所有骨肉瘤细胞比正常成骨细胞表达更多的IL-6(对< 0.001).d。qRT-PCR结果显示IL-6 mRNA在SOSP-9607、F5M2和F4人骨肉瘤细胞和对照hFOB1.19正常人成骨细胞中表达。所有骨肉瘤细胞比正常成骨细胞表达更多的IL-6(对< 0.001).e。qRT-PCR结果显示shRNA沉默后IL-6 mRNA水平。shRNA显著抑制SOSP-9607和F5M2细胞系中IL-6 mRNA的表达(对< 0.001).f、。shRNA沉默后通过蛋白质印迹检测IL-6蛋白。**g、。**ImageJ分析了IL-6蛋白的相对表达水平。shRNA可有效抑制SOSP-9607和F5M2细胞中IL-6蛋白的表达(对< 0.001).小时。GFP-9607、9607-shIL-6、GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞（200×）的GFP荧光图像*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001.

**图2。shRNA治疗后抑制细胞增殖、迁移和侵袭**
a。GFP-9607和9607-shIL-6细胞的MTT分析。9607-shIL-6细胞的增殖率明显低于GFP-9607细胞(对< 0.001).b。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的MTT分析。F5M2-shIL-6细胞的增殖率显著低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001)c。GFP-9607和9607-shIL-6细胞集落形成分析的代表性图像。d。9607-shIL-6细胞的集落形成效率显著低于GFP-9607细胞(对< 0.01).e。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞集落形成分析的代表性图像。**f、。**F5M2-shIL-6细胞的集落形成效率显著低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001).g、。Transwell迁移分析中GFP-9607和9607-shIL-6细胞的代表性图像。**小时。**9607-shIL-6细胞的迁移率低于GFP-9607细胞(对< 0.001).i、。Transwell侵袭试验中GFP-9607和9607-shIL-6细胞的代表性图像。j。9607-shIL-6细胞的侵袭能力低于GFP-9607细胞(对< 0.001).k、。Transwell迁移测定中GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的代表性图像。**l、。**F5M2-shIL-6细胞的迁移率低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001).米。Transwell侵袭试验中GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的代表性图像。。F5M2-shIL-6细胞的侵袭能力低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001). *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001.

**图3。rhIL-6治疗后F5M2细胞的信号通路激活**
a。根据蛋白质印迹，p-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT、STAT3、p-ERK1/2和AKT的表达变化。在rhIL-6治疗的前30分钟检测到p-STAT3和p-ERK1/2，表明rhIL-6激活JAK/STAT3和MAPK/ERK1/2通路，但不激活PI3K/AKT通路。b。MTT法检测不同浓度STAT3抑制剂隐丹参酮或ERK1/2抑制剂FR180204处理的F5M2细胞。与对照DMSO相比，这两种抑制剂都降低了F5M2细胞的增殖(对< 0.001). 隐丹参酮的抑制作用明显大于FR180204(对< 0.001). 预计违约概率50_隐丹参酮=19.03μM和ED50_{法国财务报告180204}=89.20微米。c。在rhIL-6孵育前用50μM隐丹参酮预处理F5M2细胞有效降低p-STAT3水平。d。在rhIL-6孵育之前，用2μM FR180204预处理F5M2细胞有效地降低了p-ERK1/2的表达。e。在Transwell迁移分析中，在rhIL-6孵育之前，F5M2细胞在有或无抑制剂治疗下的代表性图像。**f、。**隐丹参酮而非FR180204显著抑制rhIL-6引起的细胞迁移(对< 0.001). *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001.

**图4。IL-6 shRNA抑制裸鼠原发性肿瘤的生长和转移**
a。裸鼠模型中原发性GFP-F5M2和F5M2-shIL-6肿瘤的代表性图像。b。F5M2-shIL-6组的肿瘤体积小于对照GFP-F5M2组的肿瘤体积(对< 0.05).c。F5M2-shIL-6组的肿瘤重量低于对照GFP-F5M2组(对< 0.05).d。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6组原发性肿瘤的代表性H&E染色石蜡包埋切片（200×）。e。裸鼠模型中原发性GFP-9607和9607-shIL-6肿瘤的代表性图像。**f、。**9607-shIL-6组的肿瘤体积小于对照GFP-9607组(对< 0.05).g、。9607-shIL-6组的肿瘤重量小于对照GFP-9607组的肿瘤重量(对< 0.05).小时。原发性GFP-9607和9607-shIL-6肿瘤的H&E染色石蜡包埋切片的代表性图像（200×）。**i、。**裸鼠模型中GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞肺转移的代表性图像。j。F5M2-shIL-6组的肺重量低于对照GFP-F5M2组(对< 0.01).k、。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6组（200×）肺H&E染色石蜡包埋切片的代表性图像。l。裸鼠模型中GFP-9607和9607-shIL-6细胞肺转移的代表性图像。米。9607-shIL-6组的肺重量小于对照GFP-9607组(对< 0.05).。GFP-9607和9607-shIL-6组（200×）H&E染色石蜡包埋肺切片的代表性图像*对< 0.05, **对< 0.01.

**图5。IL-6 shRNA和隐丹参酮均抑制CTC植入原发性肿瘤**
利用RFP-F5M2细胞建立肿瘤自接种裸鼠模型的原发肿瘤冰冻切片的代表性荧光图像a。或RFP-F4细胞b。作为CTC。在肿瘤自接种裸鼠模型中，F5M2细胞的接种能力明显高于F4细胞。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，红色和蓝色荧光图像融合。冷冻切片在荧光观察（200×）后进行H&E染色。c。使用RFP-F5M2细胞作为CTC建立的肿瘤自接种裸鼠模型的GFP-9607原发肿瘤冰冻切片的代表性荧光图像。d。用RFP-F5M2细胞作为CTC建立的肿瘤自接种裸鼠模型的9607-shIL-6原发肿瘤冰冻切片的代表性荧光图像。e。GFP-9607原发性肿瘤冷冻切片的代表性荧光图像，该肿瘤来自一个用隐丹参酮治疗并用RFP-F5M2细胞作为CTC建立的肿瘤自接种裸鼠模型。用DAPI对所有切片（c、d和e）进行复染，并合并红色、绿色和蓝色荧光图像。与对照组相比，IL-6 shRNA-和隐丹参酮治疗组显示出对CTC种子的抑制。

**图6。骨肉瘤患者IL-6高表达与术后复发的关系**
a。临床骨肉瘤标本石蜡包埋切片中IL-6++、++、+和–表达的代表性图像（200×）。所有切片均用苏木精溶液复染。b。在骨肉瘤标本中，高IL-6表达（+++）与术后复发密切相关，使用Yates校正的Chi-square检验(对< 0.05).

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