Oncogenic Myc Induces Expression of Glutamine Synthetase through Promoter Demethylation

doi:10.1016/j.cmet.2015.09.025

。2015年12月1日；22(6):1068-77.

doi:10.1016/j.cmet.2015.09.025。 Epub 2015年10月23日。

致癌Myc通过启动子去甲基化诱导谷氨酰胺合成酶表达

附属公司

¹美国纽约州石溪市石溪大学分子遗传学和微生物学系，邮编：11794。
²美国纽约石溪大学分子遗传学和微生物学系，石溪，11794；台湾台南市701国立成工大学生命科学系。
^三加拿大QC H3G 1Y6蒙特利尔麦吉尔大学生理学系。
⁴美国纽约州石溪市石溪大学应用数学系，邮编：11794。
⁵美国纽约州石溪市石溪大学病理学系，邮编：11794。
⁶格拉斯哥大学癌症科学研究所和英国格拉斯哥G61 1BD CRUK Beatson研究所。
⁷美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学药理学系44106。
⁸美国新泽西州普林斯顿大学化学系和路易斯·西格勒综合基因组研究所，邮编08544。
⁹美国纽约州石溪大学分子遗传学和微生物学系，地址：11794weixing.zong@pharmacy.rutgers.edu。

PMID： 26603296
预防性维修识别码：项目经理4670565
内政部： 2016年10月10日/j.cmet.2015.09.025

致癌Myc通过启动子去甲基化诱导谷氨酰胺合成酶表达

亚历克斯·J·博特等人。单元格元。 2015。

。2015年12月1日；22（6）：1068-77。

doi:10.1016/j.cmet.2015.09.025。 Epub 2015年10月23日。

附属公司

¹美国纽约州石溪市石溪大学分子遗传学和微生物学系，邮编：11794。
²美国纽约石溪大学分子遗传学和微生物学系，石溪，11794；国立成功大学生命科学系，台湾台南市701。
^三加拿大QC H3G 1Y6蒙特利尔麦吉尔大学生理学系。
⁴美国纽约州石溪市石溪大学应用数学系，邮编：11794。
⁵美国纽约州石溪市石溪大学病理学系，邮编：11794。
⁶格拉斯哥大学癌症科学研究所和英国格拉斯哥G61 1BD CRUK Beatson研究所。
⁷凯斯西储大学药理学系，美国俄亥俄州克利夫兰44106。
⁸美国新泽西州普林斯顿大学化学系和路易斯·西格勒综合基因组研究所，邮编08544。
⁹美国纽约州石溪大学分子遗传学和微生物学系，地址：11794weixing.zong@pharmacy.rutgers.edu。

PMID： 26603296
预防性维修识别码：项目经理4670565
内政部： 2016年10月10日/j.cmet.2015.09.025

摘要

已知c-Myc通过上调谷氨酰胺酶（GLS）促进谷氨酰胺的使用，GLS将谷氨酰胺转化为谷氨酸，谷氨酸在TCA循环中分解代谢。在这里，我们报告了在许多人类和小鼠细胞和癌症中，Myc诱导谷氨酸-氨连接酶（GLUL）的高表达，也称为谷氨酰胺合成酶（GS），它催化谷氨酸和氨从头合成谷氨酰胺。这是通过上调Myc转录靶点胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG），促进GS启动子的活性去甲基化及其表达增加。GS的高表达可促进谷氨酰胺限制下的细胞存活，而GS的沉默可降低细胞增殖和异种移植瘤生长。GS过度表达后，谷氨酰胺增加会促进核苷酸合成和氨基酸转运。这些结果表明，Myc在诱导谷氨酰胺合成方面发挥了意想不到的作用，并表明DNA去甲基化和Myc驱动的癌症中谷氨酰胺代谢之间存在分子联系。

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数字

**图1。Myc上调GS表达**
（A–D）FL5.12亲本细胞和AM克隆（AM10和AM32）在对照培养基中培养36小时，Dox激活Akt，4-OHT激活Myc，或两者都激活。小鼠cDNA阵列显示GS转录物的折叠变化（A）。通过qRT-PCR测定的相对GS转录水平显示为三份典型实验的平均值加SEM（B）。细胞裂解物通过免疫印迹（C）进行分析。测定了GS活性，并显示为至少5个独立实验的平均值加SEM（D）。（E） 2个月大的Pdx1-Cre胰腺；LSL-KRasG12D（n=4）和年龄匹配的Pdx1-Cre；LSL-KRasG12D；用IHC对R26-LSL-MYC（n=4）小鼠进行GS染色。一：岛屿；N：正常组织；T：肿瘤。请注意，来自病毒-Cre诱导的LSL-KRas的GS.（F）小鼠肺肿瘤细胞的正常胰岛染色呈阳性^G12D系列; 第53页^{飞行/飞行}小鼠感染了pBabe-MycER^T2段并用乙醇载体或100nM 4-OHT处理24小时。mRNA进行Illumina测序。GS mRNA水平表示为测序读取次数（平均值加SD（n=4））。用载体或pBabec-Myc稳定转染（G-J）MCF10A细胞。细胞进行免疫印迹（G）。对细胞生长进行了测量，并显示为三个独立实验的代表性实验的平均值加SD（H）。通过qRT-PCR分析的GS转录水平显示为重复进行的3个独立实验的平均值加SEM（I）。GS活性显示为3个独立实验的平均值加SEM（J）。（K） T细胞淋巴瘤中Myc-high组和Myc-low组GS的差异表达水平。图示为GS表达水平的方框图。Myc高表达组和Myc低表达组由Myc表达高于或低于中间水平定义。（五十）指示细胞系被指示的shRNAs稳定感染，并进行免疫印迹。

**图2。Myc通过TDG介导的GS启动子去甲基化上调GS表达**
（A）检测显示的乳腺癌细胞株的GS表达。（B） CpG在5′-调控区的分布示意图*GLUL公司*CpG岛搜索器中的基因(http://www.cpgislands.com). CpG位点由垂直勾号表示，外显子1的开头被描述为“+1”。（C）用20μM 5-氮杂胞苷（5-Aza）处理MCF10A细胞和Hs578T细胞。通过qRT-PCR测定的GS转录水平显示为三份典型实验的平均值加SEM。（D）通过有限稀释建立载体控制和Myc表达MCF10A细胞的单细胞克隆。在每种细胞类型的5个克隆中对GS启动子进行PCR扩增，并通过硫酸氢盐测序进行分析。图中显示了测序结果和带有编号CpG的人类GS启动子的示意图。开口圆圈和填充圆圈分别表示非甲基化和甲基化胞嘧啶。（E）用qRT-PCR分析Myc表达的MCF10A细胞中的TDG转录水平，显示为5个独立实验的平均值加SEM，共进行3次。（F）在Myc表达的MCF10A细胞中测定DNA脱甲基酶活性，并显示为4个独立实验的平均值加SEM。（G）用吉西他滨处理载体控制（v）和Myc-expressing（m）MCF10A细胞24小时，并进行免疫印迹。（H）通过使用Myc抗体的ChIP分析以及启动子内两个特定区域的PCR（PCR#1和PCR#2），分析Myc表达MCF10A细胞中Myc与TDG启动子结合的水平。折叠增强表示IgG对照物上丰富的DNA片段。（一）用pGL3控制载体、野生型TDG启动子或TDG启动因子突变体驱动的荧光素酶报告子转染MCF10A细胞，两个E-box分别或同时发生突变，并与肾素荧光素素酶构建物一起转染。24小时后对细胞裂解物中的荧光素酶活性进行量化，并根据肾小球荧光素酸酶活性进行标准化，并将其归一化为pGL3转染细胞的荧光素酶活性（三份典型实验的平均值加SD）。（J）将FL5.12-AM32细胞在4-OHT中培养以诱导Myc活化。通过qRT-PCR测定的GS和TDG转录水平显示为两个独立实验的平均值加SEM，实验分三次进行。（K） MCF10A细胞被指示的shRNAs稳定感染。通过qRT-PCR（三份实验的平均值加SEM）分析TDG转录水平。

**图3。GS导致谷氨酰胺合成的反补体流量增加，并促进核苷酸合成**
（A）用载体控制或GS稳定转染Hs578T细胞¹⁵N-氨氮₄用GC-MS测定谷氨酰胺缺乏介质中6 h的Cl和谷氨酰胺中的氮掺入量。对谷氨酰胺同位素的分数进行归一化，以获得稳定的同位素天然丰度。（C–F）GS表达的Hs578T细胞的代谢追踪分析。细胞在无谷氨酰胺培养基中培养16 h，然后用12.5 mM标记¹³C-葡萄糖在无谷氨酰胺培养基中培养6小时。相对丰度¹²C和¹³每个代谢物池中的C通过GC-MS测量，并相对于内部标准物和每个样品中的蛋白质含量表示，标准化为¹²载体控制细胞中的C组分（C：谷氨酰胺，D：谷氨酸，E：α-KG，F：其他指示代谢物）。所有数据代表总标记，即所有同位素。所示为3个（某些情况下为2个）样本的平均值加SD。（G）用标记细胞16小时¹⁵N-氨氮₄谷氨酰胺-补体（2 mM）培养基中的Cl，并进行LC-MS。每种的百分比¹⁵图中显示了N标记的分子。所有数据代表总标签（平均值加上3个样本的标准偏差）。（H） MCF10A细胞被标记为¹⁵N-氨氮₄用GC-MS测定无谷氨酰胺培养基中6 h的Cl和谷氨酰胺中的氮掺入量。将谷氨酰胺总库归一化为稳定同位素天然丰度。（I和J）MCF10A细胞被指示的shRNAs稳定感染。（一）显示GS消音成功。（J）用标记细胞16小时¹⁵N-硝酸₄谷氨酰胺-补体（2 mM）培养基中的Cl，并进行LC-MS。每种的百分比¹⁵图中显示了N标记的分子。所有数据均表示总标记（平均值加上三份独立实验代表的SD）。

**图4。GS促进氨基酸摄取和肿瘤发生**
（A）检测Hs578T细胞在基础条件下、氨基酸提取（KRB）下和单独谷氨酰胺剥夺5小时后的亮氨酸摄取。在不含钠的EBSS中检测亮氨酸的系统L依赖性摄取，并通过使用系统L抑制剂BCH进行确认。（B） Hs578T细胞培养基中的细胞外谷氨酰胺水平。将浓度标准化为蛋白质浓度，并显示为载体细胞的倍数变化（以三等分进行的两个实验的平均值加SD）。（C） Hs578T细胞在无谷氨酰胺培养基中培养。细胞活力显示为三个独立实验的平均值加SD。含shNTC或shGS的（D和E）Myc-expressing MCF10A细胞在完全培养基（D）或无谷氨酰胺培养基（E）中培养。测量细胞生长（D）和细胞活力（E）。（F和G）用两种独立的GS shRNA稳定地感染指示的细胞系。成功静音如图（F）所示。测量细胞在完全培养基中的生长（G）。（H）检测感染两个单独GS-shRNAs的MDA-MB-231细胞的自发细胞死亡。（一）将表达Myc的MCF10A细胞培养在完全或无谷氨酰胺的培养基中，在没有或存在GS抑制剂蛋氨酸亚砜（MSO）的情况下。48小时后测量细胞活力。（J和K）MCF10A细胞在完全培养基或无谷氨酰胺培养基中培养，不存在或存在MSO（J）或GLS抑制剂BPTES（K）。48小时后测量细胞活力。（L-N）MDA-MB-468细胞被Tet-诱导的GS shRNA稳定感染，并进行免疫印迹（L）。测量细胞生长（M）。将细胞皮下注射到裸鼠两侧。给小鼠喂食不含（n=8）或含（n=10）盐酸多西环素（1 mg/ml）的饲料。显示平均肿瘤大小和扫描电镜。肿瘤图像显示在插页中。

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[7] DeBerardinis RJ、Lum JJ、Hatzivassiliou G、Thompson CB。癌症生物学：代谢重组刺激细胞生长和增殖。单元格元数据。2008;7:11–20.-公共医学

[8] DeBerardinis RJ、Lum JJ、Hatzivassiliou G、Thompson CB。癌症生物学：代谢重组刺激细胞生长和增殖。单元格元数据。2008;7:11–20.-公共医学

[9] DeBerardinis RJ、Mancuso A、Daikhin E、Nissim I、Yudkoff M、Wehrli S、Thompson CB。除了有氧糖酵解：转化细胞可以参与谷氨酰胺代谢，这超过了蛋白质和核苷酸合成的要求。美国国家科学院院刊2007；104:19345–19350.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] DeBerardinis RJ、Mancuso A、Daikhin E、Nissim I、Yudkoff M、Wehrli S、Thompson CB。除了有氧糖酵解：转化细胞可以参与谷氨酰胺代谢，这超过了蛋白质和核苷酸合成的要求。美国国家科学院院刊2007；104:19345–19350.-项目管理咨询公司-公共医学

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