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.2016年7月21日；35(29):3880-6.
doi:10.1038/onc.2015.437。 Epub 2015年11月23日。

Kras（G12D）诱导小鼠胰腺导管上皮细胞EGFR-MYC交叉信号

S Diersch公司 1, M Wirth先生 1, C Schneeweis公司 1, S Jörs公司 1, F盖斯勒 1, J T Siveke公司 1 2, R半径 1, R M施密德 1, D绍尔 1, A K拉斯基 三 4 5 6, M Reichert先生 1 三 6, G Schneider公司 1
附属公司

Kras（G12D）诱导小鼠胰腺导管上皮细胞EGFR-MYC交叉信号

S Diersch公司等。 癌基因. .

摘要

表皮生长因子受体（EGFR）信号在致癌Kras驱动的胰腺癌发生中起着关键作用。然而，该信令网络的下游目标在很大程度上是未知的。我们利用小鼠原代胰腺导管上皮细胞（PDECs）开发了一种新的模型系统，该细胞通过基因工程使内源性启动子中致癌Kras（G12D）的时间特异性表达。我们发现，原发性PDEC易受Kras（G12D）驱动的转化，并在体内Cdkn2a失活后形成胰腺导管腺癌。此外，我们证明Kras（G12D）的激活会诱导EGFR信号环来驱动增殖。有趣的是，药物抑制EGFR并不能降低Kras（G12D）激活的ERK或PI3K信号。相反，我们的数据提供了新的证据，证明EGFR信号是激活致癌和促增殖转录因子c-MYC所必需的。EGFR和c-MYC已被证明对胰腺癌的发生至关重要。重要的是，我们的数据将这两种途径联系起来，从而解释了EGFR在Kras（G12D）驱动的胰腺癌变中的关键作用。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。PDEC中典型Kras信号的激活
A） 激活Kras的基因策略G12D系列-PDEC中的表达(26年CreERT2公司;LSL-Kras公司G12D系列/+). PDEC和鼠线的隔离在补充材料和方法一节中有详细描述。所有动物研究都是按照欧洲实验动物护理和使用指南进行的，并得到了慕尼黑理工大学动物护理与使用委员会（IACUC）、Regierung von Oberbayern和宾夕法尼亚大学的批准。这个26年CreERT2公司和中描述了鼠标线LSL-Kras公司G12D系列中的行。B） 用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）（200 nM）（Sigma-Aldrich，München，Germany）随时间处理的指示PDEC的基因分型PCR。WT：野生型等位基因；低成本：Lox-Stop-Lox箱等位基因；STOP del：重组LSL等位基因。补充材料和方法部分描述了引物序列。C） Ras下拉分析（Raf-RBD蛋白GST珠（美国科罗拉多州丹佛市细胞骨架）），来自载体或4-OHT（200 nM）处理的PDEC。老鼠KrasG12D系列-以PDAC细胞系PPT-6037为阳性对照。pan-Ras表达的Western blot（克隆10，#05-516，Merck-Millipore，Darmstadt，Germany）（β-actin（Sigma-Aldrich）：负载控制）去除不相关的通道，合并来自同一凝胶。D） 在指定的时间点（α-微管蛋白（Sigma-Aldrich）：负荷控制）内，来自载体或4-OHT（200 nM）处理的PDEC的磷酸化ERK（Thr202/Tyr204）（#4370，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）和pan-ERK（#4696，Cell信号技术）的Western blot。E） ERK磷酸化的量化。来自的PDEC26年CreERT2公司;LSL-Kras公司G12D系列/+随着时间的推移，用4-OHT（200 nM）处理小鼠。在western blots中测定pan-ERK和phospho-ERK，并使用奥德赛红外成像系统（德国巴德洪堡Li-Cor Biosciences）进行量化，确保测量在线性范围内。显示了使用四个单独的PDEC系的四个独立实验的相对ERK磷酸化。
图2
图2。喀斯特G12D系列-PDEC中的促增殖依赖于EGFR-loop
A） R26中PDEC的白光显微图像CreERT2公司;LSL-Kras公司G12D系列/+用200 nM 4-OHT处理五天的小鼠或留作溶媒处理对照。比例尺：100μm。B） 来自的PDEC26年CreERT2公司;LSL-Kras公司G12D系列/+用200 nM 4-OHT处理小鼠或留作溶媒处理对照。7天后，播种50000个PDEC，并在另外两天内测定细胞数量（两个生物复制作为三倍进行）。C） 来自的PDEC26年CreERT2公司;LSL-Kras公司G12D系列/+随着时间的推移，用200 nM 4-OHT处理小鼠，并在western blots中测量细胞周期蛋白D1（（HD11）、sc-246、Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Tx，USA）和细胞周期蛋白A（（H-432）、sc-751，Santa Cru z Biotechnology）的表达。不同的裂解产物被印迹到不同的膜上，负载量由β-肌动蛋白控制。D） EGFR特征和相应热图的富集图（Kras诱导的前20个EGFR控制基因G12D系列)来自载体（对照：ctrl.）或4-OHT（200 nM，3天）处理的PDEC的微阵列。NES：归一化富集分数；FDR：错误发现率。EMBL-EBI ArrayExpress登录号：E-MTAB-2592。有关微阵列分析和基因集富集分析的描述，请参阅补充材料和方法。E） 相对两性调节蛋白(阿雷格)以及表雄激素（Ereg）用qPCR测定4-OHT（200 nM）处理的PDEC中mRNA的表达亲环蛋白mRNA表达作为参考。补充材料和方法中描述了底漆。单向方差分析*p值<0.05。F） 如图所示，用4-OHT（500 nM）和厄洛替尼或吉非替尼（各10μM；美国马萨诸塞州沃本市LC实验室）处理PDEC 6天。F） phospho-EGFR（#2234，细胞信号技术）和pan-EGFR（（1005），sc-03，Santa Cruz Biotechnology）western blot（α-微管蛋白：负荷对照）。G） 细胞周期蛋白D1和磷酸化Rb（#8516，细胞信号技术）western blot。不同的裂解产物被印迹到不同的膜上，负载量由β-肌动蛋白控制。
图3
图3。MYC是EGFR的下游效应物
用4-OHT（500 nM）处理PDEC 6天，并在最后24小时内添加吉非替尼或厄洛替尼（各10μM），如图所示。A）磷酸化-和泛-ERK的蛋白质印迹（α-微管蛋白：负荷对照）。B） phospho-AKT（#9271和#9275，细胞信号传递技术）和-GSK3β（#9323，细胞信号传导技术）以及pan-AKT（（C67E7），#4691，细胞信号技术）。不同的裂解产物被印迹到不同的膜上，负载量由β-肌动蛋白控制。C） phospho-STAT3（（D3A7），#9145，细胞信号技术）和pan-SATA3（（C-20）：sc-482，Santa Cruz Biotechnology）western blot。D） EGFR抑制剂（EGFRi）处理的PDEC中转录因子基因签名（TFT-MigDB）显著下调。PDEC按A）所述进行治疗。E） 根据A所述处理PDEC微阵列的MYC特征和相应热图（EGFR抑制剂抑制的前40个MYC控制基因）的GSEA富集图。NES：归一化富集分数；FDR：错误发现率。EMBL-EBI ArrayExpress接入号码：E-MTAB-2592。有关微阵列分析和基因集富集分析的描述，请参阅补充材料和方法。F） PDEC按A）所述进行治疗。相对Ccna2、E2F1、eIf4e、Hspe1、Skp2、Ncl、，和奥迪c1mRNA表达水平通过qPCR测定内参mRNA表达作为参考。补充材料和方法中描述了底漆。单向方差分析*p值<0.05。G） 2个月大的PDECPdx1 Flp；FSF-Kras公司第12天/+;FSF-R26型CAG-核心2;26年毫吨/毫克;MYC公司液氧/液氧分离小鼠。在这些细胞中Kras的表达G12D系列被诱导体内而floxed基因的表达可以通过4-OHT处理细胞来控制。用4-OHT（500 nM）处理细胞24小时。绿色荧光蛋白（GFP）表达细胞是最近描述的FACS（荧光激活细胞分选）。相对Myc公司,Ccna2、E2f1、Hspe1、Ncl、，和奥迪c1mRNA表达水平通过qPCR测定内参mRNA表达作为参考，并与未经处理的细胞进行比较，其中表达设置为1。这个Pdx1 Flp，FSF Kras公司G12D系列和FSF-R26CAG-核心-ERT2最近在中描述了鼠标线。R26毫吨/毫克中描述了鼠标线MYC公司液氧中的行。
图4
图4。MYC表达受自分泌型EGFR-loop调控
A） 随着时间的推移，用4-OHT（500 nM）处理显示的PDEC。磷酸化-MYC的Western blot（#9401，细胞信号技术）（β-肌动蛋白：负载控制）。B） 如图所示，用4-OHT（500 nM）处理PDEC。在最后24小时的培养中添加吉非替尼或厄洛替尼（各10μM）。磷酸化MYC和MYC的Westernblot（#9402，细胞信号技术）。不同的裂解物被印在不同的膜上，负载量由β-肌动蛋白或α-微管蛋白控制，如图所示。为了检测磷酸化MYC，PDEC在蛋白负载缓冲液中直接煮沸进行裂解。C） 用4-OHT（500 nM）治疗显示的PDEC 6天。在最后24小时的培养中添加吉非替尼或厄洛替尼（各10μM）。相对Myc公司mRNA表达水平通过qPCR测定内参mRNA表达作为参考。单向方差分析*p值<0.05。D） 激活Kras的基因策略G12D系列-中的表达式Hnf1β-阳性PDEC(Hnf1b-核心呃;LSL-Kras公司G12D系列/+;26年汤姆). 这个Hnf1b-核心呃中描述了鼠标线26年汤姆记者用鼠标线输入。E） 来自的PDECHnf1b-核心呃;LSL-Kras公司G12D系列/+;26年汤姆用4-OHT（1μM）处理小鼠15天。然后再加入吉非替尼或埃洛替尼（各10μM）24小时，或将细胞作为载体处理的对照。磷酸-EGFR、pan-EGFR，磷酸-ERK和pan-ERK、MYC和磷酸-Rb的Western blot。不同的裂解物被印在不同的膜上，负载量由β-肌动蛋白或α-微管蛋白控制，如图所示。F） 来自的PDECHnf1b-核心呃;LSL-Kras公司G12D系列/+;26年汤姆用4-OHT（1μM）处理小鼠15天。然后再添加吉非替尼或厄洛替尼（各10μM）24小时。相对Myc公司mRNA表达水平通过qPCR测定内参mRNA表达作为参考。G） 来自的PDECHnf1b-核心呃;LSL-Kras公司G12D系列/+;26年汤姆用4-OHT（1μM）处理小鼠15天。然后，将每孔2.000个细胞四倍接种在96孔板中（n=4）。24小时后，用厄洛替尼（10μM）、吉非替尼（100μM）或10058-F4（80μM）处理细胞，或留作溶媒处理对照。为了确定相对生长，使用BMG FLUOstar OPTIMA Microplate Reader（BMG Labtech，Ortenberg，Germany）在8天内每天测量荧光（激发：560 nm，发射590 nm）。单向方差分析*p值<0.05。
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