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.2016年1月5日；7(1):610-21.
doi:10.18632/目标6311。

线粒体谷氨酰胺酶活性抑制逆转非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药

谢彩凤 1, Jin江波 1, 徐杰宝 1, 魏华展 1, 田玉涵 1, 明溪甘 1, 张成福 1, 王建斌 1
附属公司

线粒体谷氨酰胺酶活性抑制逆转非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药

谢彩凤等人。 Oncotarget公司. .

摘要

表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）埃洛替尼在过去十年中对非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床疗效得到批准。不幸的是，癌细胞通过各种机制对这种药物产生耐药性，这限制了患者预后的改善。因此，迫切需要开发新的药物来克服埃洛替尼耐药性。在此，我们提出了一种新的策略，通过抑制谷氨酰胺酶活性来克服NSCLC中获得性厄洛替尼耐药性。谷氨酰胺酶C（GAC）抑制剂化合物968与厄洛替尼合用时，可有效抑制厄洛替尼可耐受的NSCLC细胞HCC827ER和NCI-H1975的细胞增殖。化合物968与厄洛替尼联合使用不仅降低了HCC827ER细胞中GAC和EGFR蛋白的表达，而且抑制了GAC活性。GAC基因敲除和拯救实验证明，埃洛替尼耐药细胞的生长具有谷氨酰胺依赖性。更重要的是，化合物968与厄洛替尼合用可下调厄洛替尼可耐受细胞中的谷氨酰胺和糖酵解代谢。综上所述，我们的研究为通过阻断谷氨酰胺代谢来克服获得性埃洛替尼耐药提供了一种有价值的方法，并建议EGFR-TKI和GAC抑制剂联合应用可能是获得性埃罗替尼耐药非小细胞肺癌的潜在治疗策略。

关键词：表皮生长因子受体；厄洛替尼；谷氨酰胺酶抑制剂-968；非小细胞肺癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。HCC827ER细胞对厄洛替尼耐药
(A类)细胞生长测定。HCC827和HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用浓度增加的厄洛替尼处理48小时，或不处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）***P（P）< 0.001. (B类)软琼脂分析。将HCC827和HCC827ER细胞与添加0.3%agrose和10%FBS的RPMI 1640混合，并在添加0.5%agrose及10%FBS RPMI 1640.用埃洛替尼（1μM）处理细胞或未处理细胞。在生长14天后对菌落进行评分。100%表示计数的500个单元格。(C类)上述软琼脂分析中菌落形成的统计分析。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）**P（P）< 0.01.
图2
图2。HCC827和HCC827ER细胞的生长依赖于谷氨酰胺
(A类)HCC827（1×105每孔细胞数）和HCC827ER细胞数（1×105每孔细胞数）在含有或不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养6天。每天统计细胞数量。计算在含有谷氨酰胺（300 mg/L L-谷氨酰胺）的培养基中培养的细胞数量作为对照。数据显示为三个实验的平均值±S.D***P（P）< 0.001. (B类)用靶向GAC的对照siRNA或siRNA1和siRNA2转染HCC827细胞。细胞按指定天数生长并计数。未经处理的细胞作为对照。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (C类)用对照siRNA或靶向GAC的siRNA1和siRNA2转染HCC827ER细胞。细胞按指定天数生长并计数。未经处理的细胞作为对照。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (D类)通过Western blot（顶面板）测定siRNA敲除HCC827和HCC827ER细胞中GAC的效率。转染pCDNA 3.1-V5-GAC后，测定GAC在HCC827和HCC827ER细胞中的拯救效率（底部面板）。(E类)用靶向GAC的对照siRNA或siRNA1和siRNA2转染HCC827细胞。24小时后，将V5-GAC质粒转染HCC827细胞。在指定的天数内计算细胞数。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (F类)用对照siRNA或靶向GAC的siRNA1和siRNA2转染HCC827ER细胞。24小时后，将V5-GAC质粒转染HCC827ER细胞。在指定的天数内计算细胞数。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）***P（P）< 0.001.
图3
图3。化合物968与厄洛替尼联合应用对HCC827ER细胞的生长具有协同抑制作用
(A类)饱和密度分析。用或不增加化合物968浓度的方法处理细胞6天，胰蛋白酶化并计数。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (B类)HCC827和HCC827ER细胞在添加有10%FBS的RPMI 1640中培养，并用化合物968（10μM）或厄洛替尼（1μM），或化合物968与厄洛替尼联用48小时或未经处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）***P（P）< 0.001. (C类)HCC827ER细胞在添加有10%FBS的RPMI 1640中培养，并用厄洛替尼（1μM）和增加浓度的化合物968（5、10、20和40μM）联合处理，或用化合物968，10μM和增加浓度厄洛替尼布（0.5、1、2和4μM）联用处理48小时或未经处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (D类)时间进程实验。HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用化合物968（10μM）、厄洛替尼（1μM）或化合物968与厄洛替尼联用（1μM）处理不同时间或未处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.
图4
图4。化合物968和厄洛替尼联合使用也会降低其他非小细胞肺癌细胞系的生长
(A类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用不同浓度的厄洛替尼（0.01、0.05、0.1、0.5、1和2μM）处理48 h或未处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）。(B类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用不同浓度的化合物968（0、5、10和20μM）处理48 h或未处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (C类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用厄洛替尼（1μM）和增加浓度的化合物968（5、10和20μM）处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (D类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加有10%FBS的RPMI 1640中培养，并用化合物968（10μM）和增加浓度的埃洛替尼（0.01、0.1、1和2μM）处理48小时或不处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图5
图5。化合物968通过阻断HCC827ER细胞GAC活性逆转获得性埃洛替尼耐药
(A类)HCC827细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用0、1、5和10μM浓度的化合物968处理48小时（左面板）或用10μM化合物968治疗0、12、24和48小时（右面板）。Western blot检测EGFR和GAC的表达。(B类)HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用0、1、5和10μM浓度的化合物968处理48小时（左面板）或用10μM化合物968治疗0、12、24和48小时（右面板）。Western blot检测EGFR和GAC的表达。(C类)HCC827（左面板）和HCC827ER（右面板）细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，分别用化合物968（10μM）、埃洛替尼（1μM）或化合物968和埃洛替尼加用（1μM）处理48小时。Western blot检测EGFR和GAC的表达。(D类)HCC827和HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，分别用化合物968（10μM）、埃洛替尼（1μM）或化合物968与埃洛替尼联用48小时，然后从不同细胞中分离线粒体，用谷氨酰胺酶活性测定法测定GAC活性。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6。化合物968和厄洛替尼联合抑制谷氨酰胺和糖酵解代谢
谷氨酰胺的浓度(A类)，谷氨酸(B类)，葡萄糖(C类)，乳酸(D类)和ATP(E类)在HCC827、HCC827ER细胞或用化合物968（10μM）联合厄洛替尼（1μM）处理的HCC827%细胞中检测到。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (F类)本研究中糖酵解和谷氨酰胺代谢产物的总图。
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