跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2015年12月4日；427(24):3877-89.
doi:10.1016/j.jmb.2015.10.010。 Epub 2015年10月23日。

大肠杆菌Hsp70和Hsp90直接相互作用协同蛋白质重塑

奥利维尔·基内斯特 1, 乔尔·霍斯金斯 1, 安德里亚·克拉瓦茨 1, 香农·M·道尔 2, 苏·威克纳 三
附属公司

大肠杆菌Hsp70和Hsp90直接相互作用协同蛋白质重塑

奥利维尔·基内斯特等。 分子生物学杂志. .

摘要

Hsp90是一种高度保守的分子伴侣，可重塑数百种客户蛋白，其中许多参与癌症和其他疾病的进展。它与Hsp70伴侣和许多耳蜗共同作用。细菌Hsp90与Hsp70伴侣DnaK一起起作用，但与Hsp90同系物无关。我们探索了大肠杆菌Hsp90和DnaK之间的协作，发现这两个伴侣形成了一个通过客户蛋白结合稳定的复合物。J域蛋白CbpA促进Hsp90Ec-DnaK客户复合物的组装。我们鉴定了体内DnaK相互作用缺陷的大肠杆菌Hsp90突变体，并表明纯化的突变蛋白在与DnaK的物理和功能相互作用方面存在缺陷。了解Hsp90和Hsp70如何在蛋白质重塑中协作，将为针对多伴侣和耳蜗的新治疗策略的开发奠定基础。

关键词：CbpA；DnaJ；热休克蛋白40；分子伴侣；蛋白质重塑。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
DnaK-Hsp90的稳定性Ec公司复合物存在于客户蛋白和耳蜗酮中。(A、 B类)DnaK与Hsp90的相互作用Ec公司在L2、CbpA和GrpE存在或不存在的情况下。按照使用生物素化DnaK的方法中所述进行下拉分析。通过SDS-PAGE分析与DnaK-生物素相关的蛋白质。考马斯蓝染色显示蛋白质；热休克蛋白90Ec公司使用Hsp90进行免疫印迹分析Ec公司抗血清。(一个)含有生物素化DnaK D45C、Hsp90的下拉分析Ec公司、L2、CbpA和GrpE。(B类)检测包含生物素化DnaK D45C、生物素化的DnaK野生型或所示的生物素化D naK突变体Hsp90Ec公司如图所示为野生型或突变型，CbpA和L2。在A–B中，2.4μM DnaK，3.6μM Hsp90Ec公司使用了2.3μM L2、0.4μM CbpA和0.13μM GrpE。M表示DnaK，Hsp90Ec公司、L2、CbpA和GrpE作为标记物。在A、 B类显示了来自三个或更多独立实验的代表性凝胶。
图2
图2
热休克蛋白90Ec公司和DnaK在ATP水解中协同作用。(一个)用DnaK、Hsp90水解ATPEc公司或DnaK和Hsp90的组合Ec公司7个重复的数据以平均值±SEM表示。单独使用DnaK和Hsp90水解的附加值Ec公司单独显示为黑色阴影条，旨在帮助读者。(B类)Hsp90水解ATPEc公司、DnaK或Hsp90Ec公司和DnaK在L2浓度增加的情况下。(C类)野生型或突变型Hsp90组合的ATP酶活性Ec公司和DnaK，无论是否存在1μM L2。在指定位置添加凝胶霉素（30μM）。(D类)野生型或突变型DnaK和Hsp90组合的ATP酶活性Ec公司无论L2是否存在。在A–D使用1μM野生型或突变DnaK、1μM野型或突变Hsp90测定ATP酶Ec公司和1μM L2。在B–C，来自3个或更多重复的数据以平均值±SEM表示C类和D类，虚线表示野生型Hsp90的附加ATP酶活性Ec公司与L2和野生型DnaK与L2，旨在帮助眼睛。
图3
图3
Hsp90的鉴定Ec公司参与体内DnaK相互作用的氨基酸残基。(A、 B类)DnaK与Hsp90的相互作用Ec公司体内细菌双杂交系统中的野生型或突变型，如方法中所述。DnaK融合到百日咳鲍特菌腺苷酸环化酶，T25。热休克蛋白90Ec公司野生型和突变体分别融合到另一个结构域T18。T25-DnaK与每个T18-Hsp90共表达Ec公司突变体分别位于塞浦路斯-Δ高温高压气体细胞与DnaK和Hsp90的相互作用Ec公司通过报告基因β-半乳糖苷酶在MacConkey指示板上的表达来监测野生型或突变体(一个)和液体分析(B类). 在一个图中显示了三个独立实验的代表板。在B类β-半乳糖苷酶活性显示为平均值±SEM（n=3）。(C类)Hsp90晶体结构的表面渲染模型Ec公司使用PYMOL将载脂蛋白形式的二聚体（pdb:2ioq）的C端结构域与隔离的C端区域（pdb:1sf8）的晶体结构对齐(网址：www.pymol.org). 一个原生质体是灰色的。其他原单体的NBD、M结构域和C末端结构域分别为淡蓝色、小麦色和淡绿色。对突变的残基进行标记和着色。
图4
图4
热休克蛋白90Ec公司M结构域突变体在体外的DnaK相互作用中是有缺陷的。(一个)DnaK与Hsp90的相互作用Ec公司通过测量[三H] 野生型或突变型Hsp90浓度增加时，纤维素过滤器上的DnaK具有100-kDa排除极限Ec公司，如方法中所述。(B类)DnaK与Hsp90的相互作用Ec公司通过超滤测定野生型或突变型或BSA一个使用1μM Hsp90Ec公司. (C类)DnaK D45C-生物素与野生型或突变型Hsp90的相互作用Ec公司在L2和CbpA存在的情况下，按照方法中的描述进行测定。采用免疫印迹分析和SDS-PAGE考马斯蓝染色分析DnaK相关蛋白。在A、 B类，来自至少3个重复的数据显示为平均值±SEM一个，野生型、R355C、R355L、G270A/K271A和E269C的表观Kd值分别为0.42、1.49、1.79、1.53和0.85μM。在C类，2.4μM DnaK，3.6μM Hsp90Ec公司使用了2.3μM L2和0.4μM CbpA，并显示了来自三个独立实验的代表性凝胶。
图5
图5
热休克蛋白90Ec公司DnaK相互作用缺陷的突变体在与DnaK的功能协作中存在缺陷。(一个)野生型或突变型Hsp90的ATP酶活性Ec公司在L2不存在或存在的情况下，如方法中所述进行测量。(B类)在存在野生型或突变型Hsp90的情况下测定ATP酶活性Ec公司DnaK和L2。L2和Hsp90存在下DnaK水解ATP的加值Ec公司第二语言中的WT或突变体用灰色条显示，以帮助读者阅读。(C类)按照使用Hsp90的方法中所述，随着时间的推移，监测热变性荧光素酶的反应Ec公司结合DnaK、CbpA和GrpE的野生型或突变型。野生型，黑色；R267C，橙色；K354C，紫色；E269C，蓝色；G270A/K271A，粉红色；R355L，红色；R355C，绿色；K238C，浅蓝色；DnaK、CbpA、GrpE单独存在，黑色，带开圆圈；热变性荧光素酶单独，灰色。在A–C，来自至少3个重复的数据显示为平均值±SEM。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • 结构转换调节Grp94的伴侣活性。
    Amankwah YS、Fleifil Y、Unruh E、Collins P、Wang Y、Vitou K、Bates A、Obaseki I、Sugoor M、Alao JP、McCarrick RM、Gewirth DT、Sahu ID、Li Z、Lorigan GA、Kravats AN。 Amankwah YS等人。 美国国家科学院院刊2024年3月19日；121（12）：e2309326121。doi:10.1073/pnas.2309326121。Epub 2024年3月14日。 美国国家科学院院刊，2024年。 PMID：38483986
  • 伴侣导向蛋白质折叠的分子机制：来自原子模拟的见解。
    Castelli M、Magni A、Bonollo G、Pavoni S、Frigerio F、Oliveira ASF、Cinquini F、Serapian SA、Colombo G。 Castelli M等人。 蛋白质科学。2023年12月25日；33（3）：第4880页。doi:10.1002/pro.4880。打印前在线。 蛋白质科学。2023 PMID：38145386 免费PMC文章。
  • 基于结构域的比较功能基因组学治疗药物靶点发现方法。
    Gollapalli P、Rudrapa S、Kumar V、Santosh Kumar HS。 Gollapalli P等人。 分子进化杂志。2023年10月；91(5):598-615. doi:10.1007/s00239-023-10129-w.Epub 2023年8月25日。 分子进化杂志。2023 PMID：37626222 审查。
  • 人类小分子热休克蛋白B8抑制蛋白质聚集而不影响天然折叠过程。
    Choudhary D、Mediani L、Avellaneda MJ、Bjarnason S、Alberti S、Boczek EE、Heidarsson PO、Mossa A、Carra S、Tans SJ、Cecconi C。 Choudhary D等人。 《美国化学学会杂志》，2023年7月19日；145(28):15188-15196. doi:10.1021/jacs.3c02022。Epub 2023年7月6日。 《美国化学学会杂志》，2023年。 PMID：37411010 免费PMC文章。
  • J域蛋白质与Hsp90形成二元络合物，与Hsp90-Hsp70形成三元络合物。
    Wickramaratne AC、Liao JY、Doyle SM、Hoskins JR、Puller G、Scott ML、Alao JP、Obaseki I、Dinan JC、Maity TK、Jenkins LM、Kravats AN、Wickner S。 Wickramaratne AC等人。 分子生物学杂志。2023年9月1日；435(17):168184. doi:10.1016/j.jmb.2023.168184。Epub 2023年6月20日。 分子生物学杂志。2023 PMID：37348754
查看所有“被引用”文章

参考文献

    1. 约翰逊JL。不同Hsp90同源物和耳蜗酮蛋白的进化和功能。Biochim生物物理学报。2012;1823:607–13.-公共医学
    1. 梅耶议员。分子伴侣体操。分子细胞。2010;39:321–31.-公共医学
    1. Pearl LH，Prodromou C.Hsp90分子伴侣机制的结构和机制。生物化学年度收益。2006;75:271–94.-公共医学
    1. Rohl A、Rohrberg J、Buchner J。伴侣Hsp90：为苛刻的客户更换合作伙伴。生物化学科学趋势。2013;38:253–62.-公共医学
    1. 基因O等。揭示热休克蛋白90的一个区域，该区域对大肠杆菌中的客户结合和酵母中的伴侣功能很重要。分子细胞。2013;49:464–73.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

LinkOut-更多资源