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.2015年12月11日；290(50):29707-16.
doi:10.1074/jbc。M115.688771。 Epub 2015年10月14日。

低氧通过p53蛋白依赖性诱导Bhlhe40蛋白抑制肌源性分化

王超（Chao Wang） 1, 刘伟一 1, 刘左军 1, 陈龙 2, 刘晓琦 三, 邝世欢 4
附属公司

低氧通过p53蛋白依赖性诱导Bhlhe40蛋白抑制肌源性分化

王超（Chao Wang）等。 生物化学杂志. .

摘要

卫星细胞是肌肉依赖性干细胞，能够自我更新和分化，修复受损肌肉。然而，肌肉损伤往往导致缺血缺氧环境，阻碍卫星细胞分化，降低肌肉再生效率。在这里，我们进行了微阵列分析，并确定了基本的helix-loop-helix家族转录因子Bhlhe40作为缺氧肌源性抑制效应的候选介体。Bhlhe40在卫星细胞衍生的原代成肌细胞中由缺氧强烈诱导。Bhlhe40的过度表达抑制了Myog的表达，并模拟了缺氧对肌生成的影响。相反，Bhlhe40的抑制上调Myog的表达并促进肌源性分化。重要的是，Bhlhe40基因敲除可在缺氧条件下挽救肌源性分化。从机制上讲，Bhlhe40与Myog启动子的近端E-box结合，并降低MyoD对Myog的结合亲和力和转录活性。有趣的是，缺氧诱导Bhlhe40的表达不依赖于HIF1α，而是通过一种新的p53依赖性信号通路。我们的研究确立了Bhlhe40在介导缺氧对肌源性分化的抑制作用中的关键作用，并表明抑制Bhlhe 40或p53可能促进缺血损伤后的肌肉再生。

关键词：碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH）；区别；缺氧；肌肉再生；p53；骨骼肌。

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数字

图1。
图1。
微阵列分析鉴定原代成肌细胞中的低氧调节基因。 A类，受缺氧影响的基因（-倍变化≥2和第页≤0.01）在两个生物重复中进行合并和筛选，包括641个上调基因和224个下调基因。B类，热图显示了受缺氧调节的选择性途径和基因。绿色表明下调的基因和途径，以及红色(橙色)显示上调的基因和途径。C类，-倍增加Bhlhe40公司缺氧条件下与常压下比较。D类Bhlhe40在常氧和缺氧条件下的相对蛋白水平。
图2。
图2。
Bhlhe40过表达下调Myog并抑制原代成肌细胞的分化。 A类和B类，诱导原代成肌细胞分化(DF公司)为期1天(A类)和3天(B类)在他们被腺病毒感染后（对照组和Bhlhe40运行经验，两者均表达GFP）。分化的成肌细胞用MF20染色(红色)，用DAPI对细胞核进行复染(蓝色).C类取血清24h后成肌细胞分化指数。通过将肌管中的细胞核数（MF20阳性细长细胞）除以细胞核总数来计算分化指数。只有腺病毒感染的细胞(绿色细胞）用于定量）。n个=3个实验使用不同批次的原代成肌细胞，每个实验分析五个不同的区域。D类和E类、对照组和Bhlhe40中Bhlhe 40、Myog和MyoD的相对表达运行经验qPCR测定的成肌细胞(D类)和Western blot分析(E类).误差线代表平均值±S.D.*，第页< 0.05.
图3。
图3。
Bhlhe40敲除上调Myog的表达并促进肌源性分化。 A类和B类、原发性成肌细胞感染慢病毒（对照组和Bhlhe40杜兰特)收集用于qPCR(A类)和Western印迹(B类)分析以确定Bhlhe40和Myog的相对表达。C-E公司感染对照或Bhlhe40的稳定转导C2C12成肌细胞的三个克隆杜兰特慢病毒(KD1系列和KD2系列)进行了分析。通过qPCR测定Bhlhe40和Myog的相对表达(C类和D类)和蛋白质印迹(E类)分别是。F类、Myog免疫染色(红色)，肌球蛋白重链（MF20，绿色)和DAPI(蓝色)在三个增殖细胞克隆中。G公司，对照组和Bhlhe40中Myog阳性细胞的百分比杜兰特克隆。H（H）成肌细胞被对照组或Bhlhe感染杜兰特慢病毒被诱导分化(差异)在常氧条件下持续1-3天，并用MF20染色(红色)和DAPI(青色).我，由处理的成肌细胞形成的肌管的分化指数，如小时J，处理后成肌细胞的融合指数如所示H（H）,底部面板融合指数测量多核肌纤维中肌核的百分比。D类，天。K（K）Bhlhe40在分化过程中的蛋白质水平。n个=3个不同批次的成肌细胞，每个批次使用两个重复。误差线代表平均值±S.D.*，第页< 0.05.
图4。
图4。
Bhlhe40通过调节MyoD的DNA结合和转录活性来调节Myog的表达。 A类，示意图米格发起人。电子箱(E1级和E2级)相对于+1转录起始位点进行描述。这个实心钢筋表示由“实验程序”中描述的、PCR中使用的指定引物集扩增的区域。B类转染空载体、Bhlhe40-FLAG质粒和Bhlhe40.FLAG质粒加上Bhlhe40 shRNA慢病毒感染的成肌细胞中Bhlhe 40蛋白的相对水平。C-E公司Myog E-box启动子区的，-倍富集（如所示A类)Bhlhe40-FLAG公司(C类)和MyoD(D类和E类)分别使用FLAG和MyoD抗体通过染色质免疫沉淀测定。Bhlhe公司杜兰特增强MyoD在Myog启动子E-box区的结合活性(D类)和Bhlhe运行经验降低了MyoD在Myog启动子的E-box区域上的结合活性(E类).F类，的相对表达式Bhlhe40公司和米格MyoD中Δ感染对照或Bhlhe40的成肌细胞杜兰特慢病毒。n个=3个不同批次的原代成肌细胞，每个批次使用两个重复。误差线代表平均值±S.D.*，第页< 0.05.
图5。
图5。
对Bhlhe40的抑制可在缺氧条件下挽救肌源性分化。 A类和B类成肌细胞被对照组或Bhlhe感染杜兰特在缺氧条件下诱导慢病毒分化2天，并用MF20染色(红色)和DAPI(青色).C类分化后2天的分化指数。C类，控制。D类、对照组和对照组中Myog和Bhlhe40蛋白的相对水平Bhlhe40公司KD成肌细胞在缺氧条件下生长48小时。n个=3批不同的原代成肌细胞，每批成肌细胞分析5个不同的区域。误差线代表平均值±S.D.*，第页< 0.05.
图6。
图6。
缺氧通过p53诱导Bhlhe40，且与HIF1α无关.A类，qPCR分析Bhlhe40公司Myf5-HIF1α在成肌细胞中的表达飞行/飞行小鼠或WT小鼠在缺氧（1%O）条件下培养2)或常氧（21%O2)48小时。不同字母（a和b）表示显著差异，第页< 0.05.B类和C类，收集在缺氧和常压室中培养的成肌细胞进行qPCR(B类)和Western blot分析(C类)检测p53的表达。D类，qPCR分析Bhlhe40公司用5μ米PFT（p53抑制剂）4小时。二甲基亚砜，二甲基亚砜。E类5μg处理后成肌细胞Bhlhe40和Myog蛋白表达的Western blot分析米低氧治疗PFT(H（H）)或常氧(N个)48小时。C类，控制。F类，MF20免疫染色(红色)在常氧和缺氧条件下，添加或不添加p53抑制剂Pifithrin-α，显示成肌细胞分化（持续2天）。G公司，细胞分化指数如所示F类数据来自三个不同批次的原代成肌细胞，每个批次的成肌细胞有两个重复。误差线表示平均值±S.D.*，第页< 0.05.
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