Ligand Discovery for the Alanine-Serine-Cysteine Transporter (ASCT2, SLC1A5) from Homology Modeling and Virtual Screening

doi:10.1371/journal.pcbi.1004477

。2015年10月7日；11（10）：e1004477。

doi:10.1371/journal.pcbi.1004477。 eCollection 2015年10月。

从同源建模和虚拟筛选中发现丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白（ASCT2，SLC1A5）配体

附属公司

¹美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院蒂希癌症研究所药理学和系统治疗学系。
²美利坚合众国纽约宾厄姆顿宾厄姆敦大学化学系。
^三澳大利亚坎珀顿癌症实验室百年计划的起源；澳大利亚悉尼悉尼大学悉尼医学院。
⁴英国剑桥大学化学系。

PMID： 26444490
预防性维修识别码：项目经理4596572
内政部： 10.1371/日记.pcbi.1004477

从同源建模和虚拟筛选中发现丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白（ASCT2，SLC1A5）配体

克莱尔·科拉斯等。公共科学图书馆计算生物学。 2015。

。2015年10月7日；11（10）：e1004477。

doi:10.1371/journal.pcbi.1004477。 eCollection 2015年10月。

附属公司

¹美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院蒂希癌症研究所药理学和系统治疗学系。
²美利坚合众国纽约宾厄姆顿宾厄姆敦大学化学系。
^三澳大利亚坎珀顿癌症实验室百年计划的起源；澳大利亚悉尼悉尼大学悉尼医学院。
⁴英国剑桥大学化学系。

PMID： 26444490
预防性维修识别码：项目经理4596572
内政部： 10.1371/日记.pcbi.1004477

摘要

丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体ASCT2（SLC1A5）是一种膜蛋白，可将中性氨基酸运输到细胞内，以交换细胞内氨基酸的向外运动。ASCT2在肺和肠等外周组织中高度表达，有助于细胞内中性氨基酸浓度的稳态。ASCT2还通过将谷氨酰胺等氨基酸营养物质运输到增殖性肿瘤中，在多种癌症（如黑色素瘤）的发展中发挥重要作用。因此，ASCT2是一个具有潜在重要药理意义的关键药物靶点。在这里，我们通过计算建模和实验测试确定了七种ASCT2配体。特别是，我们基于天冬氨酸转运体GltPh在两种不同构象中的晶体结构构建同源模型。优化模型的蛋白-糖互补结合位点揭示了可以通过基于结构的药物设计靶向的新假定囊。从ZINC数据库中对药物、代谢物、片断类和铅类分子进行虚拟筛选，然后使用电生理方法对14个热门的功能测量进行实验测试，结果显示有7种配体，包括5种激活剂和2种抑制剂。例如，与任何其他已知的ASCT2天然或非天然底物相比，氨基氧烷-3-羧酸盐是一种更有效的活化剂。此外，其中两个命中抑制了ASCT2介导的谷氨酰胺摄取和黑色素瘤细胞系的增殖。我们的研究结果提高了我们对氨基酸转运体中底物特异性如何确定的理解，并为开发针对ASCT2的化学工具提供了新的支架，ASCT2是癌症和神经疾病的新兴治疗靶点。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。不同构象的ASCT2模型揭示了HP2环的门控机制。**
侧面(A类)和细胞质(B类)ASCT2模型在闭塞构造中的视图用灰色条带表示。向外开放构象的HP2环（粉红色条带）叠加在闭塞模型上。底物半胱氨酸的原子显示为球体，其中氧原子显示为红色，硫原子显示为黄色，碳原子显示为青色。钠离子显示为紫色小球。

**图2。ASCT2模型的富集图表明模型适用于生产性虚拟筛选。**
ASCT2富集图**（A）**闭塞构造，**（B）**向外开放的构象和**（C）**Asp460面向结合位点的外向开放构象。富集图用红色表示，而随机选择配体所期望的富集图用蓝色虚线表示。底部面板以半对数刻度显示富集。

**图3。ASCT2和Glt的结合位点_酸碱度形状、大小和极性不同。**
闭塞构象中ASCT2的最终模型（灰色）叠加在Glt的X射线结构上_酸碱度（粉红色）。关键残留物显示为线条，其中氧原子和氮原子分别用红色和蓝色表示；钠离子可视为紫色球体。来自Glt的L-天冬氨酸坐标_酸碱度结构用绿色棒状物描述，已知配体对接ASCT2模型得到的L-丝氨酸坐标用青色棒状物可视化。(A类)L-天冬氨酸和Glt之间的氢键_酸碱度用黄色虚线表示，在L-丝氨酸和ASCT2模型之间用黑色虚线表示。(B类)模板和模型的装订袋表面分别显示为粉红色和灰色，以便与Glt相比，可视化模型中可访问的附加袋（袋B）_酸碱度结构。

**图4。ASCT2封闭构象模型的配体结合模式揭示了底物结合的关键残基。**
所选已知配体的预测结合模式(**A-B公司**)以及本研究中确定的配体(**首席财务官**)。ASCT2结合位点的骨架原子在灰色卡通中可视化；关键残基的侧链原子用灰线表示，配体显示为青枝，氧、氮和氢原子分别显示为红色、蓝色和白色；小分子和ASCT2之间的氢键（包括残基Phe407、Gly448、Pro446、Ile445、Ser353、Thr468、Asn471）显示为灰色虚线。小分子配体是苏氨酸(A类)，2-氨基-3-（丙酰氧基）丙酸(B类)，氨基氧烷-3-羧酸盐(C类),顺式-3-羟脯氨酸(D类)，杀螨素(电子)和L-DOPS(F类).

**图5。电生理方法证实了预测的激活剂和抑制剂。**
(A类-C类)代表性的全细胞电流示踪，对应于在灰色条指示的时间施加的1 mM丙氨酸、L-DOPS和氨基氧烷-3-羧酸盐（AOC）。(D类)AOC和青霉胺的剂量响应曲线（膜电位=0 mV，内部缓冲液含有130 mM NaSCN和10 mM丙氨酸，外部缓冲液含有140 mM NaCl）。(电子)相对于1 mM丙氨酸诱导的最大全细胞电流（膜电位=0 mV，内部缓冲液含有130 mM NaSCN和10 mM丙酸，外部缓冲液含有140 mM NaCl）。

**图6。向外打开的构造揭示了一个额外的新颖口袋。**
(A类)对接衍生的已知抑制剂苄基半胱氨酸的预测结合模式。ASCT2的主链原子被视为灰色卡通，主键残基与灰色棍子中的配体建立氢键，氧、氮和氢原子分别为红色、蓝色和白色。Asp460的两种潜在的旋转体，包括朝向结合部位的方向（粉红色）和表面（灰色），显示为棒状物。钠离子以紫色球体表示。(B类)ASCT2与苄基半胱氨酸结合的外向开放模型的结合位点表面揭示了HP2开放产生的新口袋（口袋A）。

**图7。基于外向模型的有效ASCT2抑制剂的识别。**
(A类)新识别抑制剂的预测结合模式γ-固定基地计划。ASCT2绑定站点可视化为灰色卡通；关键残基的侧链原子用灰色线表示，配体显示为黄色条，氧、氮和氢原子分别用红色、蓝色和白色表示；抑制剂和ASCT2之间的氢键（包括残基Ser351、Asp464、Thr468和Asn471）显示为黑色虚线。(B类)应用丙氨酸后的代表性电流记录，γ-FBP和丙氨酸+γ-图例所示条件下的FBP。灰色条表示复合应用的持续时间。(C类)的剂量反应关系γ-FBP感应电流，括号中显示了每个数据点的平均实验次数。(D类)不同浓度丙氨酸诱导电流（100μM）γ-FBP（膜电位=0 mV，内部缓冲液含有130 mM NaSCN和10 mM丙氨酸，外部缓冲液含有140 mM NaCl）。括号中显示了每个数据点的平均实验次数。虚线表示基于*K（K）* _我87μM，与（C）进行比较。

**图8。氯丙氨酸、AOC和γ-FBP抑制ASCT2介导的C8161人黑色素瘤细胞的谷氨酰胺摄取和细胞活力。**
(A类-C类) [^三H] -使用C8161细胞中的L-谷氨酰胺摄取来确定IC₅₀氯丙氨酸、AOC和γ-FBP（n=3）。(D类-F类)用氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）和γ-FBP（5 mM）。进行双向方差分析测试以确定显著性。(**G公司**-我)用流式细胞术检测与氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mC）和γ-FBP（5 mM）。采用Mann-Whitney U检验确定显著性。（J）在与氯丙氨酸（5 mM）、AOC（5 mM）和γ-FBP（5 mM）。

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