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.2015年10月1日；60(1):105-17.
doi:10.1016/j.molcel.2015.09.005。

SRSF1调节的乳腺癌选择性剪接

奥尔加·安祖科 1, 马丁·阿克曼 1, 安托万·克莱里 2, 吴杰 三, 陈申 4, 尼汀H希罗莱 5, 阿曼达袭击者 1, 孙淑英 1, Mads A Jensen公司 1, 伊敏华 1, Frédéric H-T Allain先生 2, 阿德里安·克莱纳 6
附属公司

SRSF1调节的乳腺癌选择性剪接

奥尔加·安祖科等。 分子电池. .

摘要

剪接因子SRSF1在人类乳腺肿瘤中上调，其过度表达促进乳腺细胞的转化。利用RNA-seq，我们在模拟与乳腺癌相关的环境的三维MCF-10A细胞培养物中确定了SRSF1调节的选择性剪接（AS）靶点。我们识别并验证了数百例内源性SRSF1调节的AS事件。SRSF1结合基序的重新发现调和了以往基序分析中的差异。使用贝叶斯模型，我们确定了SRSF1结合对盒外显子的位置效应：靠近5'剪接位点的结合通常促进外显子包含，而靠近3'剪接部位的结合则促进外显基因跳跃或包含。最后，我们确定了SRSF1调节的AS事件在人类肿瘤中被解除；过表达这种亚型，外显子9包含CASC4，增加腺泡大小和增殖，减少细胞凋亡，部分重述了SRSF1的致癌作用。因此，我们揭示了SRSF1的积极和消极调节机制，以及代表治疗药物开发潜在靶点的致癌AS事件。

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数字

图1
图1。通过RNA-seq鉴定SRSF1调节的剪接事件
（A）对照组或SRSF1-OE 3-D培养的MCF-10A细胞的Acinar形态和大小。比例尺：100μm。点图显示了尺寸分布和中间尺寸。（每次实验>100个腺泡；Mann-Whitney试验***P（P）<0.0005).（B）Western blot分析含或不含多西环素（DOX）的诱导HeLa细胞以及对照细胞或SRSF1-OE 2-D或3-D生长的MCF-10A细胞中SRSF1蛋白水平。与微管蛋白负荷控制相关的标准化（n=3）。误差线，s.d。（C）RNA-seq实验和数据分析流程图。（D）在控制和SRSF1-OE单元中确定的AS事件的PSI概况。与对照细胞相比，彩色点表示SRSF1-OE中显著上调（红色）或下调（蓝色）的AS事件。（E）每类AS事件的数量：CA结合子外显子、AA-替代受体（3′SS）、AD-替代供体（5′SS）和IR-ntron保留；DOWN/UP-AS事件在SRSF1-OE细胞中下调/上调。（F）PSI绘制的跳过（蓝色）和包含（红色）SRSF1-regulated CA-exon。
图2
图2。SRSF1调节二维或三维MCF-10A细胞中的CA-exon
SRSF1调节的CA事件的代表性RT-PCR验证在以下方面发生了改变：（A）二维和三维方向相同；（B）二维和三维方向相反；（C）二维或三维，但不是两者都有。使用上游和下游外显子中的引物，通过放射性RT-PCR分析总RNA，然后进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术。每种亚型的结构都有说明（不是按比例）。CA外显子被遮蔽。对每种情况下的拼接百分比（PSI）进行量化（n≥3；t检验***P（P）<0.0005, **P（P）<0.005, *P（P）<0.05). 误差线（s.e.m）。其他验证见图S1-S2。
图3
图3。SRSF1-motif发现和在体外验证
（A）从RNA-seq数据中发现SRSF1-motif的流程图。(B-D公司)SRSF1 RRM1+2与WT和5′-UCAGAGGA-3′RNA突变版本相互作用的研究(B类)叠加1H（H）-15代表NMR滴定的N HSQC光谱15N标记的GB1-SRSF1 RRM1+2蛋白，未标记的5′-UCAGAGGA-3′RNA数量增加。对应于游离和RNA-结合蛋白状态的峰（RNA:protein比率为0.3:1和1:1时）分别为蓝色、橙色和绿色。在RNA结合上观察到的最大化学位移扰动用黑色方块表示。(C类)化学位移扰动的近景(B类). 由ITC在图D中确定的Kd和Kd比率显示在图的左侧，用于测试的每个RNA序列。(D类)GB1-SRSF1 RRM1+2与WT和5′-UCAGAGGA-3′RNA变体的ITC数据。显示了估计的Kd值。
图4
图4。SRSF1调控图和突变分析
（A）SRSF1沿包含（红色）或跳过（蓝色）CA-exon和周围序列的位置依赖性结合概率。x轴表示相对于CA（绿色框）、上游和下游外显子（黑色框）的核苷酸位置。这条线代表周围100-nt的内含子。y轴显示了在三个独立的数据集中使用三个不同的SRSF1基序导出的九个不同调控图的中位数概率（单个数据集图见图S4）。黑色三角形表示外显子包含或跳过后验概率最高的峰的位置。（B）将SR蛋白的结合概率平均在一起（SRSF2、SRSF3、SRSF5、SRSF6和SRSF7）（黑线），用相应的标准偏差（灰条）绘制，并与当前RNA-seq数据集中由三种不同SRFS1基序（红线和蓝线）导出的SRSF1结合谱进行比较。(C-D公司)SRSF1基序的产生或丢失与外显子内含子的相关性SMN2型外显子7(C类)和ADAR2公司外显子8(D类). 在每个核苷酸位置（左侧面板），对促进高（红色）或低（蓝色）外显子内含物（PSI）突变的SRSF1基序生成（阳性分数）或缺失（阴性分数）进行评分，并绘制相应的PSI水平图（右侧面板）。
图5
图5。TCGA对SRSF1-OE人乳腺肿瘤剪接的影响
SRSF1-OE肿瘤中的PSI适用于CA、AA、AD和IR事件，分为上调（红框）或下调（蓝框）AS事件。方框的阴影与每个类别中检测到的事件数量成正比。每个纵轴表示检测到AS事件的肿瘤数量。
图6
图6。SRSF1调节CASC4公司乳腺肿瘤的选择性剪接
（A）对照组和SRFS1-OE组人乳腺肿瘤中SRSF1的表达水平。（B）SRSF1-regulated的PSI得分CASC4公司（A）肿瘤的第9外显子。（C）的结构CASC4公司人类基因和第9外显子序列。（D）CASC4蛋白亚型序列。外显子9编码的氨基酸以黄色突出显示。指出了Prosite预测的翻译后改性位点。(电子)SRSF1基序和CLIP标签的位置（Sanford等人，2008年，Pandit等人，2013年）CASC4公司第9外显子。下面显示了100个脊椎动物多点对齐和保护轨迹。
图7
图7。CASC4-FL亚型部分重述了SRSF1介导的腺泡表型
(A类)RT-PCR分析CASC4公司对照MCF-10A细胞中过表达对照（空载体）或CASC4-FL cDNA的亚型，以及SRSF1-OE MCF-10A细胞和对照（空向量）或CASC-Δ9 cDNA中的亚型。对每种情况下的PSI进行量化（n=3）。误差线，s.d。（B）对照组和SRSF1-OE第8天腺泡的相对照图片，表达对照组、CASC4-FL或CASC4-Δ9结构。比例尺：50μm。（C）腺泡大小分布和中位数（n=3，每次实验>100个腺泡；Mann-Whitney检验***P（P）<0.0005).（D、E）.增殖标记物ki67第8天腺泡阳性的百分比(D类)或凋亡标记裂解的caspase-3(电子)绘制，归一化为对照腺泡（n≥3，每次实验>30个腺泡；Fisher检验***P（P）<0.0005, **P（P）<0.005, *P（P）<0.05). 误差条，s.d。
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