跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2015年9月17日；525(7569):333-8.
doi:10.1038/nature15257。 Epub 2015年9月9日。

运动皮层突触记忆痕迹的标记和光学擦除

Akiko Hayashi-Takagi先生 1 2, Sho Yagishita公司 1 三, 中村真美 1, 福寿寿司（Fukutoshi Shirai） 1, 易一物 4, 阿曼达·L·洛斯堡 5 6, 布莱恩·库尔曼 5 6, 克劳斯·M·哈恩 5 7, 哈罗·卡赛 1 三
附属公司

运动皮层突触记忆痕迹的标记和光学擦除

Akiko Hayashi-Takagi先生等。 自然。 。

摘要

树突状棘是突触可塑性的主要位点，被认为是记忆的可能结构相关物。尽管如此，对大脑皮层中特定的脊髓亚群进行系统操作是不可能的，因此，脊髓与记忆之间的联系是相关的。我们开发了一种新的突触光探针AS-PaRac1（激活的突触靶向光激活Rac1），可以特异性标记最近增强的脊髓，并诱导含有AS-PaRac1的脊髓选择性收缩。AS-PaRac1的体内成像显示，运动学习任务在一小部分神经元中诱导了实质性的突触重塑。获得性运动学习被增强的脊椎的光学收缩所干扰，而它不受同一皮层区域不同运动任务诱发的脊椎相同操作的影响。综上所述，我们的结果表明，新获得的运动技能取决于特定任务密集突触群的形成。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明。作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

数字

扩展数据图1
扩展数据图1。针对突触应用优化PaRac1
a中，等温滴定量热法（ITC）实验表明，在原始PaRac1结构中引入L514K和L531E突变后，在黑暗中与PAK1的CRIB结构域的结合减少，分别作为阴性和阳性对照。b条在转染原始PaRac1的海马神经元培养物中，我们观察到体细胞有胡须状外观，并有大量异位树突，而转染PaRacl（L514K/L531E）的神经元与正常神经元无明显区别。c（c），使用下拉分析评估PaRac1与内源性PAK1的亲和力。将转染PaRac1-Venus的HEK293细胞分为亮细胞和暗细胞两组。亮细胞组的细胞在细胞溶解前用白色荧光灯照射，在随后的免疫沉淀过程中持续光照，直到蛋白沉淀剂的最后清洗步骤。相反，用黄色荧光灯照射暗组中的细胞，该荧光灯排除了500nm以下的光波长。与PAK1共免疫沉淀显示，PaRac1（L514K/L531E）在黑暗中几乎与PAK1结合（试验数量如条形图所示**P（P）<0.01（使用Mann-Whitney U检验）。天，将PaRac1靶向突触后密度。PSDΔ1.2-PaRac1[DTE（−）]在体外21天转染到分离的皮层神经元（DIV）。转染后两天，用4%PFA固定细胞，然后进行渗透处理，用于随后的免疫染色程序。分别使用抗磷神经丝和抗PSD-95抗体对轴突和内源性PSD-95进行可视化，显示PSDΔ1.2-PaRac1与内源性PSD-95共定位。请注意，PSDΔ1.2-PaRac1没有与轴突标记物共存。
扩展数据图2
扩展数据图2。AS-PaRac1的分布受神经元活动调节，并依赖树突状靶向元件（DTE）
a、，实验设计。b条，培养海马神经元的代表性图像。c（c）在指定的时间点将荷包牡丹碱（BIC）或河豚毒素（TTX）添加到培养基中。图像以高倍放大率拍摄，并平铺以可视化整个细胞。绿色圆圈代表AS-PaRac1点。天，AS-PaRac1分布的量化(n个=6/个*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，使用Kruskal-Wallis检验，然后使用事后Dennett检验）。e（电子），AS-PaRac1和SEP-GluA1在脊椎中的伴随积累。用mTq（mTurquoise，filler）、SEP-GluA1和AS-PaRac1-mRFP共同转染神经元，并将构建物表达36 h。SEP-Glu A1荧光（箭头）显示36 h内增强的脊髓。Spearman秩相关揭示了SEP-GluA1和AS-PaRac1的脊柱富集指数之间的显著相关性（每个圆圈代表一个脊柱，235个脊柱，29个树突）。f、，FSK（箭头）存在下，谷氨酸解封引起的单个脊柱增强的结构和代表性图像示意图。用AS-PaRac1或PSD-PaRac1[DTE（−）]对大鼠海马切片培养物进行生物转染，然后在DIV 13（相当于出生后第20天）进行去壳实验。克，脊柱头部容积的时间进程(V（V）)和金星在不封顶时的堆积。脊柱大小的平均变化和金星在受刺激或邻近脊柱中的积聚在去盖后60分钟被描绘出来。为了量化，我们使用了来自相同设计的独立实验的汇集数据。AS-PaRac1的数据集与图1中FSK治疗组相同c–e类.比例尺，1μm*P（P）<0.05，使用Mann-Whitney U检验(n个=PSD-PaRac1或AS-PaRac1分别为6或11个树枝晶）。
扩展数据图3
扩展数据图3。增强脊髓中AS-PaRac1特定浓度的推测细胞机制
一，用缺乏DTE的PSD-PaRac1构建物对脊椎进行统一标记弧3′UTR（图1a，构造B）。PSD-PaRac1在配备了大量翻译机器的体细胞中翻译。因此，探针的体细胞蛋白表达很高（数据未显示），这将超过降解的数量，并且产生的蛋白质通过树突运输。溢出的探针在PSD分子的结构转换过程中整合到突触后密度（PSD）中。因此，探针的表达与脊柱大小成正比。b条，用AS-PaRac1选择性标记增强的脊髓（图1a，结构C）。以下六种机制赋予AS-PaRac1增强特异性标记。（1） 少量体细胞翻译：AS-PaRac1的适度基因表达，通过这种表达，AS-PaRac1蛋白的翻译在体细胞中受到限制（参见扩展数据图2b），因此，该探针从体细胞到树突的非特异性溢出是最小的。（2） 树突状靶向元件（DTE）：AS-PaRac1的基本结构域是N末端PSD-95（PSDΔ1.2）和弧mRNA（DTE）。DTE在mRNA的树突状靶向中起着关键作用,。最著名的DTE之一出现在弧mRNA，以活性依赖的方式靶向刺激的树突状片段。mRNA从体细胞外的转运也导致了（1）中所述的体细胞内探针的有限翻译。在缺乏激活的情况下，树突中有限的翻译机制和降解成分使局部翻译探针保持在较低水平，这导致在PSD蛋白的组成性转换期间AS-PaRac1整合到PSD的速率较低。（3） 局部蛋白质合成：脊椎持续的结构可塑性取决于蛋白质的活性依赖性树突状合成，以及弧信使核糖核酸是由活性水平控制的。（4） 在结构增强的棘中有效捕获PSD蛋白：增强的棘快速需要PSD蛋白的新拷贝，更有效地捕获扩散的PSD蛋白,（5）增加PSD中AS-PaRac1的稳定性：PSD整合的AS-PaRac1的稳定可能增加，典型的PSD支架蛋白也是如此。泛素化可能是增加稳定性的机制，因为AS-PaRac1的泛素化位点位于PSD-95的N末端结构域，其结构域聚集在突触后支架中形成头对头的多聚酶化。因此，一旦AS-PaRac1整合到PSD中，泛素化位点可能会被隐藏，AS-PaRac1变得相对稳定。（6） 未结合的AS-PaRac1对蛋白酶体降解的敏感性：与PSD-整合的AS-Pa Rac1相反，未结合的AS-PaRac 1对降解敏感，因为泛素化位点没有被隐藏。这种情况得到了乳胱氨酸蛋白酶抑制剂（右面板）的支持，它抑制蛋白酶体，从而完全破坏AS-PaRac1的不均匀分布。类似的机制与新形成的脊椎有关，因为脊椎的形成与脊椎的扩大有关。
扩展数据图4
扩展数据图4。量化和突触映射的原始数据如图2所示
a、，根据脊椎的分类，分别描述学习后脊椎大小的量化（基于DsRed荧光）和AS-PaRac1荧光。右侧描述了“新脊椎”、“扩大脊椎”等的定义。每个箭头指示脊椎的轨迹；起点和终点分别表示rotarod任务前后的绝对值。b条XY图像是从硬脑膜深度300μm处以1.0μm的步长拍摄的，并通过每个像素处荧光值的总和进行叠加。将10个重叠区域的Z堆叠图像对齐以生成组合图像。显示AS-PaRac1和AS-PaRac1/DsRed合并图像。描述了学习前出现的AS-PaRac1（−1天，黄色）、学习后不久（学习期，0天，绿色）、1天（学习期后-1天，+1天，蓝色）或学习后2天（学习后-2天，+2天，紫色），以显示每个周期中触发的AS-Pa Rac1的时空分布。c（c），每个时期AS-PaRac1-阳性棘的数量和分数的时间过程。天，计算学习诱发脊柱/神经元比率（%）。计算示例基于中显示的原始数据b条和c（c）表中显示了第II/III层神经元之间的比较(子宫内E14.5处的EP）和第V层(子宫内E13处的EP）。
扩展数据图5
扩展数据图5。树突轴上AS-PaRac1穿孔的评估
一，AS-PaRac1点可能在树突轴上代表的两种可能的突触类型。采集XY图像，以包含感兴趣树枝晶的整个Z范围，步长为0.5μm，并通过每个像素处荧光值的总和对图像进行叠加。如果AS-PaRac1点状突起出现在经历结构增强的树突棘上，填料和AS-PaRac1的荧光都会增加。相反，如果AS-PaRac1位于轴突触中，填充物的荧光不会增加。b条，AS-PaRac1出现前后的枝晶示例。轴和树突棘上的AS-PaRac1点分别用（i）和（ii）表示。显示了用于计算每个点中荧光的ROI。c（c），出现AS-PaRac1点时填料和AS-PaRac1的荧光定量。每个箭头指示每个ROI的轨迹；起点和终点分别表示AS-PaRac1出现之前和之后的绝对值。（i）处的ROI在填料和AS-PaRac1中均显示出伴随的荧光增加，与典型树突棘中的AS-PaRac1相似（ii）。所有检测到的树突轴上的AS-PaRac1点状突起均显示出正相关性，这表明在脊柱结构改变期间，大多数AS-PaRac1点阵突起出现在树突棘上。
扩展数据图6
扩展数据图6。低频PA诱导树突棘的Rac1依赖性收缩
一PA.PA协议在包含相关分支的区域执行。b条，将左侧示意图中所示的DNA结构生物转染海马切片培养物（DIV 11）中的神经元。PA上具有代表性的树枝状图像显示在右侧。在SARE-Arc启动子驱动的转染AS-PaRac1的脊髓中观察到强烈收缩（箭头）。尽管它们与AS-PaRac1阳性棘相邻，但AS-PaRac1阴性棘不受PA影响。c（c），脊柱头部容积的时间进程(V（V）)静脉阳性（上面板）和阴性脊椎（下面板）。白色、红色和蓝色圆圈分别表示CAG：：AS-PaRac1、SARE:：AS-Pa Rac1和SARE:∶PSDΔ1.2-LOV-DTE(n个=12个单元/个）。天PA后60分钟，静脉阳性和阴性脊柱中脊柱头部大小的平均相对变化。比例尺，2μm*P（P）<0.05和***P（P）<0.001根据克鲁斯卡尔·沃利斯检验和事后舍夫检验。
扩展数据图7
扩展数据图7。蓝色激光照射引起双侧运动皮质大面积脊柱萎缩
一，双侧颅骨窗、光纤和PA协议示意图。b条，PA后M1皮层脊柱收缩的典型图像体内.AS-PaRac1-阳性棘（绿色箭头）缩小，而AS-PaRac1-阴性棘（白色箭头）没有缩小。脊椎大小的量化如右图所示。c（c），在图4i所示的小鼠中计算每个场AS-PaRac1穿孔的平均数。天,e（电子）对小鼠的脊柱结构和AS-PaRac1进行成像，这些小鼠接受了图5所示的再训练和家庭笼协议。大多数AS-PaRac1阳性脊髓显示出PA诱导的收缩和随后的恢复*P（P）<0.05，根据Mann-Whitney U检验。（f）行为测试后mRFP荧光的出现证实了AAV5载体注射到双侧M1皮层的成功。Emx1免疫染色显示病毒感染第II/III层和第V层锥体神经元的高效性，并标记锥体神经元。将M1皮层无双侧mRFP信号的小鼠排除在数据分析之外。
扩展数据图8
扩展数据图8。PA对小鼠运动活动无影响
一，实验时间表。使用视频跟踪系统测量方案#1（图4a）中AS-PaRac1注射小鼠的跑步速度。为了尽量减少昼夜节律对运动的影响，在PA前后的同一时间对小鼠进行测试。b条描述了运动的典型轨迹和运行速度的时间序列。c（c）统计分析表明，PA对运行速度的影响微不足道。
扩展数据图9
扩展数据图9。图4中旋转天线和波束任务的详细说明
一，实验流程图。b条旋翼机训练/测试、运动测试和PA的详细时间表。c（c）为了缩短训练时间，对小鼠后肢进行喷气作为厌恶性刺激，以保持小鼠在杆上的前视位置，从而提高了运动成绩，尤其是在较高速度下。天，光束测试示意图。在测试之前，进行了为期6小时、持续2天的培训。
图1
图1。海马薄片培养中AS-PaRac1对树突棘的电位依赖性积累
一，探针离散分布的基本域映射（箭头）。b条，在存在或不存在福斯科林（FSK）和茴香霉素的情况下，谷氨酸去壳（箭头）增强单棘的典型图像。c、 天、脊柱头部容积的时间进程(c（c）)和AS-PaRac1积累(天). 受刺激或邻近脊椎的平均变化为60分钟后的无盖状态。e（电子），lactacystin对AS-PaRac1（箭头）离散累积的影响。比例尺，2μm。扩展数据表中描述了统计方法/结果的详细信息。
图2
图2。AS-PaRac1标记的时空动力学体内在rotarod任务期间
一，电弧促进器驱动的AS-PaRac1示意图。b条，实验设计。c（c）脊柱形成（箭头）和脊柱扩大（箭头）的图像。绿圈，AS-PaRac1；洋红色圆圈，最初获得AP-PaRac1但后来失去它的棘，但结构变化持续存在。天，脊椎结构变化的分数。e–g、脊柱大小量化和AS-PaRac1(e（电子）). AS-PaRac1与ΔV（V）之后（0天，（f）)和之前（-1天，克)学习。小时，含有AS-PaRac1的棘的百分比（AS-PaRac1≥1[a.u.]，绿色阴影区域（f）).我，AS-PaRac1映射。j个、AS-PaRac1保留（绿色）或结构增强（洋红色）。k个脊柱大小的轨迹和结构增强脊柱的AS-PaRac1强度。比例尺，2μm用于c（c）; 200μm用于b条和我..
图3
图3。光活化后含AS-PaRac1脊椎的选择性收缩（PA）
a、，PA图解。b、，后肢皮层区域的图像。c、，脊椎大小与PA一致。深绿色圆圈是消除脊椎的方法。天，皮层深度对PA诱导的脊柱收缩的影响。e–j，用GCaMP6s、AS-PaRac1-Turquoise和mRFP共转染神经元。突触中GCaMP/mRFP比值（ΔR）的变化(克)和索玛(小时)被追踪。我,j个ΔV和Δ振幅之间的关系(我)，或Δ频率(j个)在PA上。圆圈1、2和S对应于脊椎#1、#2和内体克和小时.比例尺，5μm用于b条; 50μm用于e（电子），2μm用于（f）。
图4
图4。用AS-PaRac1标记的脊柱的PA对获得性学习的擦除
一，实验设计（参见扩展数据图9）。b、 c、d，小鼠被分配到#1方案(b条), #2 (c（c）)，或#3(天). 每只小鼠平均进行三次试验，作为任务表现（灰线）。e（电子）PA抹去已学技能的关键时期。（f）–小时，PA效果与学习成绩的关系。我，实验设计。j个、每项技能的表现轨迹。k个，PA对后天旋翼性能的影响与波束任务的影响无关。。
图5
图5。针对不同学习任务的突触群可视化
a、，实验设计。Arc:：AS-PaRac1和CAG:：mRFP（填料）由子宫内电穿孔。b条，学习树突图像。AS-PaRac1 punta根据其外观和持续时间进行彩色编码。相同的色码用于c–编号。c（c）,（f）,我，AS-PaRac1的宽视图映射。天,克,j个，每种脊椎类型的分数。e（电子）,小时,k个、脊柱大小的轨迹(V（V）).我,米，每种情况下的不同脊柱增强。n个，新增强的脊椎的比例。比例尺，2μm用于b条; 50μm用于c（c）,（f）和我..
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

  • 神经科学：遗忘被照亮。
    卢J，左Y。 卢杰等。 自然。2015年9月17日；525(7569):324-5. doi:10.1038/nature15211。Epub 2015年9月9日。 自然。2015 PMID：26352474 没有可用的摘要。
  • 神经科：瞄准脊椎。
    冈德森BB。 冈德森BB。 Nat方法。2015年11月；12(11):1006-7. doi:10.1038/nmeth.3644。 Nat方法。2015 PMID：26824105 没有可用的摘要。

类似文章

  • [学习和记忆背后的突触信号群的光学擦除]。
    佐藤（Sato M）、宫本茂（Miyamoto N）、千叶（Chiba K）、欧比（Obi K）、林石（Hayashi-Takagi A）。 Sato M等人。 大脑神经。2018年7月；70（7）：713-721。doi:10.11477/mf.1416201072。 大脑神经。2018 PMID：29997267 日本人。
  • 突触集成是学习过程中神经回路选择和巩固的基础。
    Hoshiba Y、Wada T、Hayashi-Takagi A。 Hoshiba Y等人。 前神经电路。2017年3月2日；11:12. doi:10.3389/fncir.2017.00012。2017年电子采集。 前神经电路。2017 PMID：28303092 免费PMC文章。 审查。
  • 神经科：瞄准脊椎。
    冈德森BB。 冈德森BB。 Nat方法。2015年11月；12(11):1006-7. doi:10.1038/nmeth.3644。 Nat方法。2015 PMID：26824105 没有可用的摘要。
  • 稳定的树突棘与终身记忆有关。
    Yang G、Pan F、Gan WB。 Yang G等人。 自然。2009年12月17日；462(7275):920-4. doi:10.1038/nature08577。Epub 2009年11月29日。 自然。2009 PMID：19946265 免费PMC文章。
  • LTP和记忆过程中的脊髓动力学和突触重塑。
    De Roo M、Klauser P、Garcia PM、Poglia L、Muller D。 De Roo M等人。 脑研究进展2008；169:199-207. doi:10.1016/S0079-6123（07）00011-8。 2008年脑研究进展。 PMID：18394475 审查。
查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Bernstein JG，Boyden ES。分析行为神经回路的视生工具。趋势认知科学。2011;15:592–600.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Tye KM，Deisseroth K。动物模型中脑疾病神经回路的光遗传学研究。《自然·神经科学评论》。2012;13:251–266.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Liu X，等。对海马印迹的视基因刺激激活恐惧记忆回忆。自然。2012;484:381–385.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Holtmaat A，Svoboda K。哺乳动物大脑中经验依赖性结构突触可塑性。《自然·神经科学评论》。2009;10:647–658.-公共医学
    1. Kasai H等人。记忆和认知中树突棘的结构动力学。《神经科学趋势》。2010;33:121–129.-公共医学

出版物类型

MeSH术语