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.2016年8月；42(5):477-92.
doi:10.1111/nan.12282。 Epub 2015年9月30日。

线粒体疾病患者浦肯野细胞和突触复合物I缺乏的研究

Alexia Chrysostomou（亚历克西亚·克里索斯托莫） 1, 约翰·P·格雷迪 1, 亚历克斯·劳德 2, 罗伯特·泰勒 1, 道格·M·特恩布尔 1, Nichola Z Lax公司 1
附属公司

线粒体疾病患者浦肯野细胞和突触复合物I缺乏的研究

Alexia Chrysostomou（亚历克西亚·克里索斯托莫）等。 神经病理学应用神经生理学. 2016年8月.

摘要

目的：小脑共济失调在线粒体疾病患者中很常见，尽管先前的神经病理学研究表明线粒体疾病患者的橄榄小脑通路易受损伤，但确切的神经退行性机制仍不清楚。我们使用定量四重免疫荧光技术精确定量Purkinje细胞体及其齿状核突触末端的线粒体呼吸链蛋白表达。

方法：我们研究了12名临床和遗传定义的线粒体疾病和共济失调患者以及10名年龄匹配的对照组中NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚单位13蛋白的表达。分子遗传学分析用于确定Purkinje细胞体和抑制性突触中突变线粒体DNA的异质性水平。

结果：我们的数据显示，Purkinje细胞体及其齿状核神经元周围的抑制性突触中都存在复杂I缺陷。抑制性突触在患者中较少且扩大，这可能是一种代偿机制。线粒体DNA异质性表明，在细胞体和突触中，线粒体DNA的突变水平同样很高。

结论：这是首次使用经验证的定量免疫荧光技术测定神经元和突触前终末复合体I的表达，评估呼吸链缺陷的分布，并评估影响突触的形态学异常程度。Purkinje细胞体及其突触中检测到的呼吸链缺陷和结构突触变化可能导致小脑回路改变和共济失调的进展。

关键词：浦肯野细胞；共济失调；线粒体DNA；线粒体疾病；呼吸链缺陷；突触。

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数字

图1
图1
线粒体蛋白表达的检测和定量P（P）urkinje细胞。小脑的四倍免疫荧光P（P）抗谷氨酸脱羧酶的urkinje细胞(谷氨酸脱羧酶-65/67）、突触素(SY公司‐38），复杂四、亚单位4(考克斯4） 和复合物1α亚复合亚单位13(NDUFA13号机组).谷氨酸脱羧酶‐65/67用于检测GABA公司能量细胞体和抑制性突触。与相结合SY公司‐38表示抑制性突触前终末的收敛。考克斯4是线粒体质量标记，并且NDUFA13号机组蛋白质用于检测复合物我缺乏。控制P（P）urkinje细胞显示共定位考克斯4和NDUFA13号机组蛋白质，表示完整的复合物我表达式，而NDUFA13号机组患者体内蛋白质显著减少P（P）urkinje细胞（复合物我不足）。P（P）上述三例患者（患者1、8和11）的urkinje细胞表现出不同程度的减少NDUFA13号机组蛋白质相对于考克斯4人在场。比例尺：7μm。
图2
图2
突触线粒体的检测与重建GABA公司能量突触。检测和重建协议的开发GABA公司齿状核神经元上的能突触前终末。顶面板：免疫荧光染色对照齿状核神经元的共焦图像用于识别抑制性突触。比例尺：7μm。放大视图：神经元周围区域谷氨酸脱羧酶‐65/67（蓝色）和突触素（紫色）点状共存是抑制性突触存在的标志。考克斯4阳性染色（红色）表示线粒体质量，以及NDUFA13号机组存在（绿色）用于检测呼吸链蛋白缺乏。比例尺：1.5μm。物体检测：由代表所用四个标记中每一个的物体所代替的实际染色。然后，线粒体对象可以被划分和过滤，以便只研究突触内的对象（最右侧）。下图：同一控制神经元上抑制性突触的三维重建，以及突触线粒体的鉴定。尺度：1单位=1.56μm。协议开发是使用Volocity®软件实现的（v.6.3.1，PerkinElmer）。
图3
图3
NDUFA13号机组蛋白质表达P（P）齿状核上的urkinje细胞及其抑制性突触。复杂我患者小脑缺陷P（P）urkinje细胞和抑制性突触以z值表示。彩色方框图表示P（P）urkinje细胞z值和清晰的箱线图反映了抑制性突触z值。在P（P）urkinje细胞，最严重的缺陷通常出现在m.3243A>G点突变的患者（患者1-6）中，患者5（m.3243A>G）表现出最显著的细胞丢失NDUFA13号机组蛋白质表达（中位数z得分=−12）。两名隐性患者POLG公司突变（患者9和10）相对较高NDUFA13号机组蛋白质表达。具有相同基因缺陷的患者在其复合体中表现出变异性我表达（患者2与。患者1和3的m.3243A>G；患者7与。患者8的m.8344A>G）。在抑制性突触中，大多数患者表现出不同程度的复合物减少我表达，患者5（m.3243A>G）和11(POLG公司)突触终末缺陷最多，而患者2（m.3243A>G）和患者10(POLG公司)与控件没有不同。
图4
图4
复杂我齿状核神经元抑制性突触缺失。量化NDUFA13号机组蛋白质在GABA公司齿状核神经元周围的能量突触（顶部面板；标尺：7μm）。控制抑制突触具有相同的表达考克斯4（线粒体质量）和NDUFA13号机组（白色箭头–左侧面板），表示完整的复合体我表达式。相反，患者抑制性突触前终末的线粒体复合物减少我表达（白色箭头），表明这些突触中的线粒体功能障碍。复杂度严重降低我相对于线粒体的表达（患者5；m.3243A>G），而在其他患者中，复合物仅存在微小差异我到考克斯4表达（患者11；POLG公司). 比例尺：1.5μm。
图5
图5
之间的相关性NMDAS系统小脑共济失调和NDUFA13号机组突触前抑制终末的蛋白表达。更严重的共济失调评分与更低的z评分有关NDUFA13号机组表达式(S公司皮尔曼ρ=−0.60，P（P）值=0.0493）。
图6
图6
抑制性突触前终末数量的变化。的数量GABA公司每个齿状核神经元上计算的能量突触(n个 = 20） 用z值表示。12名患者中有8人检测到抑制性突触前终末数量减少。所有隐性遗传患者POLG公司除了大多数患有m.3243A>G点突变的患者外，突变还表现出突触丢失。有趣的是，与对照组相比，患者3（m.3243A>G）、8（m.8344A>G）和12（m.14709T>C）的每细胞数量增加。
图7
图7
线粒体DNA隔离状态下的突变负荷P（P）urkinje细胞和抑制性突触前终末。单个隔离的异质性水平P（P）来自5名携带mtDNA点突变（m.3243A>G和m.8344A>G）的患者的浦肯野细胞体和抑制性突触前终末。单个符号表示独立的读数，条形表示中间值(n个 = 两种人群均为15人）。
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