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.2015年9月21日；212(10):1725-38.
doi:10.1084/jem.20140654。 Epub 2015年8月31日。

NOS1衍生的一氧化氮通过抑制细胞因子信号转导抑制因子-1促进NF-κB转录活性

Mirza Saqib Baig公司 1, 索菲亚·扎伊奇克 1, 毛毛 1, 安德烈·德阿布鲁 2, Farnaz R Bakhshi公司 三, 彼得·C·哈特 4, 乌兹玛·萨奇卜 三, 景登 三, 索拉布·查特吉 三, 米歇尔·布洛克 三, 斯蒂芬·M·沃格尔 三, 阿斯拉尔·马利克 三, Marcia E L Consolaro公司 5, 约翰·W·克里斯曼 三, 理查德·德米沙尔（Richard D Minshall） 6, 本杰明·甘特纳 7, 马塞洛·博尼尼 8
附属公司

NOS1衍生的一氧化氮通过抑制细胞因子信号转导抑制因子-1促进NF-κB转录活性

Mirza Saqib Baig公司等。 实验医学杂志. .

摘要

NF-κB通路是炎症调节的核心。在这里，我们证明低输出一氧化氮合酶1（NOS1或nNOS）通过促进NF-κB的活性在炎症反应中发挥关键作用。具体而言，巨噬细胞中NOS1衍生NO的产生导致细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）的蛋白水解，减轻其对NF-κB转录活性的抑制。因此，NOS1（-/-）小鼠在遭受两种不同的脓毒症模型时，细胞因子生成、肺损伤和死亡率降低。分离的NOS1（-/-）巨噬细胞在与革兰氏阴性细菌LPS的攻击中显示出类似的促炎性转录缺陷。我们一致发现，与野生型细胞相比，活化的NOS1（-/-）巨噬细胞含有增加的SOCS1蛋白和降低的p65蛋白水平。SOCS1依赖NOS1的S-亚硝化损伤其与p65的结合，并以SOCS1为蛋白水解靶点。用外源性NO处理NOS1（-/-）细胞可以挽救SOCS1降解和p65蛋白的稳定。点突变分析表明，SOCS1上的Cys147和Cys179都是NO-依赖性降解所必需的。这些发现证明了NOS1衍生NO在调节TLR4介导的炎症基因转录以及由此产生的宿主免疫反应的强度和持续时间方面的基本作用。

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数字

图1。
图1。
NOS1缺乏可防止模型脓毒症损伤。（A） WT的存续(n个= 42),NOS1号−/−(n个= 31),NOS2号−/−(n个=40），以及NOS3号−/−(n个=32）注射LPS的小鼠（30 mg/kg，i.p.），根据至少3个独立实验汇编，每组10只小鼠，或（B）WT(n个=8）和NOS1号−/−(n个=8）小鼠，从2个独立实验中汇编，进行CLP，并在指定的时间内监测存活率。（C） WT的肺部，NOS3号−/−、和NOS1号−/−在腹腔注射LPS攻击后8 h收获小鼠，并用h&E对切片进行染色。显示了三个独立实验中分析的每种表型的三只小鼠的代表性图像。棒材，100µM。（D） 肺血管通透性测量（Kfc（财务总监）)WT的，NOS3号−/−、和NOS1号−/−小鼠LPS攻击前和攻击后8小时。在三个独立实验中分析了每种表型的三只小鼠。*，P<0.05，学生t吨测试。（E） 单用LPS治疗的WT小鼠的存活率(n个=32）或在LPS前用TRIM（25 mg/kg，i.p.）预处理2 h(n个=30），根据每组10只小鼠（F）进行的至少3次独立实验汇编而成。对WT小鼠进行肺组织学分析，如C组，对照组或TRIM预处理组，如E组。使用Fisher精确试验确定A–C组的显著性。*，P<0.02（B）；**，P<0.001（E）；***，P<0.0005（A）。
图2。
图2。
LPS引起的炎症细胞因子反应在NOS1号−/−动物和培养的巨噬细胞。（A） WT血浆中IL-1α、IL-1β和IL-6，NOS1号−/−,NOS2号−/−、和NOS3号−/−小鼠注射LPS（30 mg/kg，i.p.）前和8 h后。使用Luminex面板评估血浆中的细胞因子水平，并以相对光单位（RLU）表示。对每种治疗条件和基因型的9只小鼠进行分析，并从三个独立实验中汇编数据，平均值±SEM.*，P<0.005（Student’st吨测试）。（B） 细胞因子mRNA表达的定量RT-PCR分析TNF公司,白介素-6、和IL-1β与WT隔离的BMDM和NOS1号-/−小鼠，并用LPS（250 ng/ml）刺激。*，P<0.0005。（C） mRNA表达分析TNF公司,白介素-6、和IL-1β在LPS（250 ng/ml）刺激前用TRIM（100 nM）处理2 h的WT巨噬细胞（无抑制剂）和WT巨噬细胞。*，P<0.003（学生的t吨测试）。（D） LPS激活的BMDM（250 ng/ml）培养基中TNF和IL-1β细胞因子水平的ELISA测量。*，P<0.02；**，P<0.001（学生t吨测试）。代表性数据来自三个（B–D）独立实验，用平均值±SD表示。
图3。
图3。
NOS1是NF-κB转录激活所必需的，但不是上游信号传导所必需的。（A） WT和LPS处理（250 ng/ml）后IκB降解的代表性免疫印迹NOS1号−/−BMDM。（B） IκB水平的密度分析，如（A）所示，归一化为肌动蛋白，表示为三个独立实验定量的平均值±SEM。*，P<0.02（学生的t吨测试）。（C） 从WT和NOS1号−/−LPS前后BMDM（250 ng/ml）1小时*，P<0.001，学生t吨测试。（D） 稳定表达NF-κB驱动荧光素酶报告子（ELAM）的RAW264.7巨噬细胞系用TRIM（50µM）预处理2 h，然后用LPS（100 ng/ml）刺激6 ht吨测试。C和D代表三个独立实验，表示为三个重复的平均值±SD。在用PBS（对照）、LPS或LPS治疗24小时后，用TRIM（50 mg/kg，i.p.）预处理2小时以抑制NOS1后，表达转基因荧光素酶报告子（HLL）的小鼠的（E）的代表性数字图像和（F）NF-κB转录活性的定量。静脉注射30 mg/kg荧光素后10分钟，通过IVIS评估发光。定量集中于胸部活动(n个=每组6只动物，由两个单独的实验汇编而成，每个实验使用3只小鼠），包括LPS或PBS治疗前的基础报告活性进行比较。*，P<0.05（学生的t吨测试）。平均值显示为水平条，红色表示处理过的值，蓝色表示控制值。
图4。
图4。
NOS1号−/−BMDM暴露于LPS后无法维持p65蛋白水平。用LPS（250 ng/ml）刺激的BMDM中NF-κB p65蛋白水平的代表性免疫印迹（A）和密度定量（B），归一化为肌动蛋白，用于指定的时间和基因型。如有指示，用MG132（50µM，蛋白酶体抑制剂）预处理细胞。*，P<0.01。（C） 免疫印迹分析中NF-κB p50总水平NOS1号−/−LPS后的巨噬细胞（250 ng/ml）。（D） WT和WT的分离细胞质和核组分NOS1号−/−在LPS（250 ng/ml）作用60 min前后用免疫印迹法检测BMDM的p65，GAPDH和HDAC1分别作为细胞质或核蛋白的负荷对照。在用吐麦素（100µg/ml）或对照药物治疗BMDM，然后用LPS（250 ng/ml）治疗指定时间，抑制从头合成蛋白质后，通过（E）免疫印迹和（F）密度定量（标准化为GAPDH）评估p65蛋白降解动力学。IκBα再表达的缺失表明了对蛋白质翻译的有效抑制。对于上述所有实验，3个独立实验显示了代表性的印迹，基于所有实验的定量显示为平均值±SEM。P值通过Anova双向检验和Bonferroni事后检验确定，以比较重复次数：*，P<0.02；**，P<0.001；和***，P<0.0001。
图5。
图5。
NOS1定位于巨噬细胞的细胞核，是LPS处理后快速产生NO所必需的。（A） NOS1固定和免疫染色后，在BMDM中显示了NOS1的核定位（红色），用DAPI对细胞核进行了复染，并显示了2个独立实验的代表性图像（bar，25µM）。（B） 对BMDM细胞质和细胞核部分进行免疫印迹，以证明NOS1的亚细胞定位。GAPDH和HDAC1作为亚细胞分馏的对照。（C） NOS1丝氨酸1412磷酸化与酶激活相关，通过LPS（100 ng/ml）刺激BMDM在指定时间点的免疫印迹检测。数据是三个独立实验的代表。（D） 亚硝酸盐积累作为NO生成的间接测量，在WT和NOS1号−/−在LPS之前或之后使用Sievers 280i一氧化氮分析仪进行BMDM（100 ng/ml，1 h）。*，P<0.05。（E） 过氧亚硝酸盐生成是NO生成的另一种间接测量方法，通过培养WT或NOS1号−/−BMDM加香豆素-7-硼酸（10µM）30分钟，加或不加LPS（100 ng/ml）。使用HPLC进行荧光测量。*，P<0.0003。（F） LPS诱导的定量RT-PCR分析NOS2号来自WT和NOS2蛋白的mRNA和（G）免疫印迹分析NOS1号−/−经LPS（250 ng/ml）治疗的BMDM在两种基因型BMDM LPS后的早期时间点均未检测到诱导型NOS（NOS2）。P<0.01（学生的t吨测试）。数据代表六个（D和E）和三个（F）独立实验；均表示为平均值±SD。B、C和G中的数据代表三个独立实验。
图6。
图6。
NOS1衍生NO介导SOCS1的S-亚硝化并阻止SOCS1介导的蛋白酶体降解p65（A）WT中p65和SOCS1的免疫印迹分析，NOS1号−/−,NOS2号−/−、和NOS3号−/−BMDM用LPS（250 ng/ml）处理指定时间。（B） 使用生物素开关法检测WT和NOS1号−/−BMDM用MG132（50µM）预处理1 h，然后用LPS（250 ng/ml）处理指定时间，然后进行SOCS1免疫印迹。（C）NOS2号−/−和NOS3号−/−生物素开关法分析BMDM，如B.（D）在WT和NOS1号−/−BMDM，在LPS（250 ng/ml）之前用MG132（50µM，1 h）预处理指定的时间间隔。（E） p65和SOCS1总蛋白水平的免疫印迹分析NOS1号−/−用DEANO（NO供体，5µM）和LPS（250 ng/ml）处理BMDM。所示的所有斑点代表至少两个（C和D）或三个（A、B和E）独立实验。
图7。
图7。
分子模型和功能测试表明，SOCS1的Cys147和Cys179是S-亚硝化的靶点。（A） SOCS1的蛋白质结构域说明了所有5个候选半胱氨酸残基的位置。（B） 进行分子建模以预测SOCS1半胱氨酸残基（表示为有色棒状原子模型）对可能的亚硝化供体GSNO的可及性（表示为球状和棒状原子模式）。预计半胱氨酸硫原子和GSNO的氮之间的较短距离允许Cys147（4？，中间）和Cys179（6？，右）进行S-亚硝化，而Cys43（13？，左）、Cys112（11？，未描绘）和Cys 78（11？（未描绘）预计相距太远，无法进行反应。（C） 将带有GFP标记的SOCS1结构的代表性免疫印迹或每个半胱氨酸的点突变（C147S、C179S、C112S、C78S和C43S）转染到HEK293细胞中，然后用20 ng/ml IL-1β的15分钟脉冲处理这些细胞。一些细胞用50µM蛋白酶体抑制剂预处理1小时（MG132+），一些细胞在IL-1β（NO供体+）后用10µM DEANO处理1小时。通过免疫印迹法测定SOCS1蛋白水平的稳定性，并根据三个独立实验（平均值±SEM）定量β-肌动蛋白（D）。（E） 在使用生物素切换方法瞬时转染的HEK293细胞中，将SOCS1突变体C147S和C179S的S-亚硝化能力与WT SOCS1进行比较。测定GFP-OCS1变体的免疫沉淀物的生物素（S-亚硝化），并对裂解物进行总SOCS1的免疫印迹作为对照。数据是两个独立实验的代表。
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