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.2015年9月10日；162(6):1229-41.
doi:10.1016/j.cell.2015.08.016。 Epub 2015年8月27日。

肿瘤微环境中的代谢竞争是肿瘤进展的驱动因素

张志浩 1, 景秋 1, 大卫·奥沙利文 1, 迈克尔·D·巴克 1, 野口隆 1, 乔纳森·柯蒂斯 1, 陈琼玉 1, 玛丽尔·金丁 1, 马修·M·古宾 1, Gerritje J W van der Windt先生 1, Elena Tonc公司 1, 罗伯特·施赖伯 1, 爱德华·J·皮尔斯 1, 埃里卡·皮尔斯 2
附属公司

肿瘤微环境中的代谢竞争是肿瘤进展的驱动因素

张志浩等。 单元格. .

摘要

T细胞对癌症的保护失败被认为是由于缺乏抗原识别、慢性激活和/或其他细胞的抑制所致。通过小鼠肉瘤模型，我们发现肿瘤对葡萄糖的消耗会限制T细胞的代谢，导致其mTOR活性、糖酵解能力和IFN-γ的产生减弱，从而导致肿瘤进展。我们表明，增强抗原“回归因子”肿瘤中的糖酵解足以覆盖T细胞控制肿瘤生长的保护能力。我们还发现，临床上使用的针对CTLA-4、PD-1和PD-L1的检查点阻断抗体可以恢复肿瘤微环境中的葡萄糖，允许T细胞糖酵解和IFN-γ的产生。此外，我们发现直接阻断肿瘤上的PD-L1通过抑制mTOR活性和降低糖酵解酶的表达来抑制糖酵化，这反映了PD-L1在肿瘤葡萄糖利用中的作用。我们的结果表明，肿瘤引起的代谢限制可以在癌症期间介导T细胞低反应性。

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数字

图1
图1。肿瘤介导的葡萄糖限制改变T细胞代谢并抑制其产生细胞因子的能力
(A类) 1×106将来源于d42m1的R或P肿瘤细胞皮下注射到129S6小鼠（n＝5）中。肿瘤大小显示为两个独立实验的10只小鼠的两个垂直直径±SEM的平均值。(B类)C3 T细胞单独培养，或与1:5的P或R细胞培养24h，然后PMA/离子霉素刺激±20mM葡萄糖（Glc）5h，用FACS测定IFN-γ。%IFN-γ+T细胞（右上）和平均荧光强度（MFI）（垂直）；代表≥2个独立实验。(C类)培养物中的葡萄糖浓度(B类)刺激前；表示≥2个独立实验，以平均值±SEM表示**第页=0.0087, ***第页=0.0011. (D类)ECAR和R或P肿瘤增殖。在代表≥3个独立实验的第0天和第3天测量CellTrace Violet（CTV）标记的细胞的增殖***第页=0.001. (E类)将R或P肿瘤皮下注射到129S6小鼠体内，并于第12天分离TIL。(F类)通过FACS在TIL中表达CD44、CD62L、PD-1、T-bet、磷酸化4E-BP1（p4E-BPl）和S6K（pS6K），代表了≥3个独立实验。(G公司)ECAR和OCR/ECAR体外肿瘤细胞和TIL。光学字符识别（O2消耗率）是OXPHOS的指标。数据显示为来自3个独立实验的平均值±SEM**第页=0.003, ***第页=0.001. (H（H）)TIL的最大糖酵解能力。条形图显示为平均值±SEM，代表2个独立实验。(我)在PMA/离子霉素刺激5h后测量TIL中IFN-γ的产生。IFN-γ产生细胞的轮廓图（上图）和MFI（下图）。代表≥3个独立实验。(J型)肿瘤细胞外环境中的葡萄糖浓度***第页=0.0005. 5只小鼠的平均数据。(K（K）)将2-NBDG静脉注射到荷瘤小鼠体内，15分钟后收获肿瘤。直方图（上图）描述了TIL 2-NBDG摄取。条形图（如下）显示了3只小鼠的平均MFI±SEM**第页=0.0147. 另请参见图S1。
图2
图2。体内葡萄糖竞争调节抗原特异性T细胞中mTOR活性和细胞因子的产生
(A类) 1×106或40×106将EL4-Ova细胞腹腔注射到接受2×10剂量的C57BL/6小鼠体内4天真OT-I Thy1.1+在第7天评估腹腔内的T细胞。(B类)通过FACS和1×10移植小鼠的相对MFI评估OT-I T细胞的磷酸化4E-BP1（p4E-BPl）、S6K（pS6K）和S6（pS6）6EL4-Ova细胞（1）或40×106EL4-Ova细胞（40）归一化为注射1×10的小鼠T细胞的MFI6EL4-Ova细胞。条形图显示为4个独立实验的平均值±SEM**第页=0.0085***第页=0.001。(C类)供体OT-I T细胞和CD8产生IFN-γ+和CD4+PMA/离子霉素再刺激后5小时宿主T细胞；%IFN-γ+T细胞（左上）和IFN-γ的MFI+细胞（垂直），代表2个独立实验。(D类)供体OT-I T细胞体内干扰素-γ产生。小鼠腹腔注射EL4-Ova细胞和同源的原始OT-i T细胞。7天后，小鼠腹腔注射BFA和PBS或葡萄糖，2.5小时后再次注射。第一次注射后5h收集细胞并用FACS分析。点图显示IFN-γ的MFI+与PBS治疗小鼠相关的细胞。点代表单个小鼠；水平条表示两个独立实验的平均值±SEM。*对=0.0142.
图3
图3。增强正常排斥的抗原肿瘤的糖酵解代谢促进肿瘤进展
(A类)R肿瘤在完全培养基（11 mM葡萄糖和10%FCS：R）或高糖/低FCS培养基（50 mM和1%FCS：R-1%）中培养3周以上，并测量ECAR（左）。通过FACS测量肿瘤细胞中的2-NBDG摄取量（右）。数据是3个独立实验的平均值，图5B中也使用了R组和P组的值。2-NBDG MFI归一化为R肿瘤MFI。ECAR数据代表3个独立实验***第页=0.001. (B类)129S6小鼠皮下注射1×106R或R-1%肿瘤细胞。肿瘤大小显示为两个垂直直径的平均值±SEM(C类)体外R-1%的“进展期”肿瘤和培养的R和P肿瘤细胞spectrin-β2表达。数据来自3个人体外R-1%肿瘤。(D类) 1×106将R或R-1%的肿瘤细胞皮下注射到Rag中−/−129S6小鼠和肿瘤生长监测。数据(B类和D类)来自2个独立实验。(E类)用空逆转录病毒载体（R-EV-Ctrl）或表达c-Myc（R-cMyc）、PDK1（R-PDK1）、Glut1（R-Glut1）或HK2（R-HK2）的载体转导R肿瘤细胞（R-No-Tdx），并测量ECAR；代表≥4个独立实验**第页=0.0012，R-EV控制vs.R-cMyc，第页对于R-EV Ctrl相对于R-PDK1，＝0.0091，第页对于R-EV Ctrl与R-Glut1，=0.0026，以及第页=0.0196，R-EV控制vs.R-HK2***第页=0.001，对于R-No Tdx与R-EV控制。(F类) 2×106将转导的R肿瘤细胞皮下注射到129S6小鼠体内，并监测肿瘤生长21天，代表≥3个独立实验。(G公司)转导肿瘤的Spectrin-β2表达。(H（H）)携带转基因肿瘤的小鼠在第12天静脉注射2-NBDG，并通过TIL和FACS测量肿瘤细胞获取。数据显示为根据R-EV-Ctrl标准化的TIL与肿瘤的MFI比值。点代表单个小鼠；水平条表示3个独立实验的平均值±SEM**第页=0.009，R-EV控制vs R-cMyc，第页=0.0065，R-EV控制vs R-Glut1，以及第页=0.0066，R-EV控制vs R-HK2。另请参见图S2。
图4
图4。进展性肿瘤中的T细胞在检查点阻断治疗后恢复糖酵解能力和效应器功能
(A类)129S6小鼠（n=6-8）在接种肿瘤后第3、6和9天，皮下注射R或P肿瘤细胞，并用抗CTLA-4（αCTLA-4）、抗PD-1（αPD-1）、抗-PD-L1（αPD-L1）或同种对照（Iso）抗体治疗。(B类)肿瘤大小显示为≥3个独立实验的两个垂直直径±SEM的平均值。(C–E类)第12天测量肿瘤细胞外环境中的葡萄糖浓度(C类). 将数据归一化为R-Iso肿瘤，并描述1-3个独立实验的平均值±SEM*第页=0.0208, **第页=0.0015（R vs.P-Iso）**第页=0.0024, ***第页=0.001. (D类)检查站封锁后的TIL ECAR。标准化为R-Iso肿瘤的数据，描绘了3个独立实验的平均值±SEM***第页<0.001. (E类)FACS测量TIL中4E-BP1、S6和S6K的磷酸化。条形图（左）显示为4个独立实验的平均值±SEM，直方图（右）代表4个独立试验。第4E-BP1页：*第页=0.0249, **第页=0.0047（αCTLA-4）**第页=0.0050（αPD-1）。第S6K页：**第页=0.0024（αCTLA-4）**第页=0.0025（αPD-L1）。第6页：*第页=0.0145（αCTLA-4）*第页=0.015（αPD-1）*第页=0.0134（αPD-L1）。(F类)PMA/离子霉素再刺激5h后TIL产生IFN-γIFN-γ+细胞（左上角）和IFN-γ的MFI+单元格（垂直）；代表3个独立实验。（G） 检查站封锁后TIL的OCR与ECAR（均数±SEM）。来自3个独立实验的数据。另请参见图S3。
图5
图5。PD-L1促进肿瘤细胞中mTOR活性和糖酵解代谢
用干扰素-γ预处理R或P肿瘤细胞，然后用PD-L1阻断（αPD-L1）或同型控制（Iso）抗体。(A类)ECAR后处理。来自≥5个独立实验的数据显示相对ECAR归一化为R-Iso肿瘤***第页=0.0001. (B类)通过FACS测量肿瘤细胞对2-NBDG的摄取。来自3个独立实验的数据归一化为R肿瘤MFI值***第页=0.001. (C类)western blot分析p4E-BP1、pS6K和pS6；代表3个独立实验；FACS评估的p4E-BP1和pS6K的代表性直方图。(D类)western blot检测Akt、磷酸化Akt（pAkt）和糖酵解酶PGK1、TPI和LDHa；代表3个独立实验。(E类)表达高水平PD-L1的R肿瘤克隆用抗PD-L1抗体（αPD-L1）在冰上处理15分钟，然后在冰上保存（0分钟）或在37°C下孵育30分钟（30分钟），并在酸性溶液中洗涤，以将抗体从细胞表面分离（+酸洗）或不处理（无酸洗）。固定后，用抗鼠IgG A488（红色）培养细胞，检测细胞表面的αPD-L1。渗透后，用抗大鼠IgG A647（黄色）孵育细胞，检测表面表达和内化的αPD-L1和核染色（蓝色）。通过共焦显微镜对细胞成像。代表4个独立实验的数据。(F类)转导肿瘤细胞的ECARpdl1型shRNA（PD-L1 hp）或对照hp对抗荧光素酶（Ctrl-hp）。从2个独立的实验中，表现为相对ECAR归一化为R Ctrl hp细胞***第页<0.0001. (G公司)通过蛋白质印迹检测p4E-BP1、pS6和pS6K；代表3个独立实验。(H（H）)Akt、pAkt，PGK1、LDHa和TPI的Western blot；代表3个独立实验。(我)干扰素-γ预处理的R或P肿瘤细胞（顶部）或经抗PD-L1治疗的PD-L1 hp或Ctrl-hp转导的肿瘤细胞（底部）上PD-L1的表达。(J型)用表达PD-L1的逆转录病毒转导后，表达高（Hi）和低（Lo）表面PD-L1水平的R肿瘤的ECAR，表示为2个独立实验的平均值±SEM。(K（K）)拉格牌手表−/−小鼠皮下注射2×106R-PD-L1表达肿瘤细胞，然后在移植后第2、5、8和11天用PD-L1抗体（αPD-L1）治疗。在第12天测量细胞外葡萄糖。点代表单个小鼠；水平条表示两个独立实验的平均值±SEM*第页=0.0319. 图5D，H（H）、和图S4D、G包含来自等负荷车道的单独斑点，这是因为需要单独探测的糖酵解酶大小相似。另请参见图S4。
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中的注释

  • 营养竞争：肿瘤免疫抑制的新轴心。
    Sukumar M、Roychoudhuri R、Restifo NP。 Sukumar M等人。 单元格。2015年9月10日；162(6):1206-8. doi:10.1016/j.cell.2015.08.064。 单元格。2015 PMID：26359979 免费PMC文章。

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