Supporting Aspartate Biosynthesis Is an Essential Function of Respiration in Proliferating Cells

doi:10.1016/j.cell.2015.07.017

.2015年7月30日；162(3):552-63.

doi:10.1016/j.cell.2015.07.017。

支持天冬氨酸生物合成是增殖细胞呼吸的基本功能

卢卡斯·B·沙利文¹, 丹·Y·桂¹, 亚伦·M·霍西奥斯¹, 劳伦·布什¹, Elizaveta Freinkman公司², 马修·范德·海登^三

附属公司

¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院科赫综合癌症研究所和生物学系，邮编02139。
²美国马萨诸塞州剑桥市九剑桥中心怀特海生物医学研究所，邮编：02142。
^三科赫综合癌症研究所和麻省理工学院生物学系，剑桥，马萨诸塞州02139，美国；Dana-Farber癌症研究所，美国马萨诸塞州波士顿02115，电子地址：mvh@mit.edu。

PMID： 26232225
预防性维修识别码：项目经理4522278
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2015.07.017

支持天冬氨酸生物合成是增殖细胞呼吸的基本功能

卢卡斯·B·沙利文等。单元格. 2015.

.2015年7月30日；162(3):552-63.

doi:10.1016/j.cell.2015.07.017。

作者

卢卡斯·B·沙利文¹, 丹·Y·桂¹, 亚伦·M·霍西奥斯¹, 劳伦·布什¹, Elizaveta Freinkman公司², 马修·范德海登^三

附属公司

¹美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院科赫综合癌症研究所和生物学系，邮编02139。
²美国马萨诸塞州剑桥市九剑桥中心怀特海生物医学研究所，邮编：02142。
^三科赫综合癌症研究所和麻省理工学院生物学系，剑桥，马萨诸塞州02139，美国；Dana-Farber癌症研究所，美国马萨诸塞州波士顿02115，电子地址：mvh@mit.edu。

PMID： 26232225
预防性维修识别码：下午4点522278分
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2015.07.017

摘要

线粒体呼吸对细胞增殖很重要；然而，呼吸支持增殖所满足的特定代谢需求尚未确定。这里，我们表明呼吸在增殖细胞中的主要作用是为天冬氨酸合成提供电子受体。这一发现与缺乏功能性呼吸链的细胞对丙酮酸营养不良的观察结果一致，丙酮酸是一种外源性电子受体。此外，丙酮酸的需求可以通过替代电子受体α-酮丁酸来满足，该受体既不提供碳也不提供ATP。当呼吸受到抑制时，α-酮丁酸可恢复增殖，这表明替代电子受体可以替代呼吸来支持增殖。我们发现，电子受体限制了天冬氨酸的产生，在缺乏外源电子受体的情况下，提供天冬氨酸能促进呼吸缺陷细胞的增殖。总之，这些数据表明，在增殖细胞中呼吸的主要功能是支持天冬氨酸的合成。

PubMed免责声明

数字

**图1。细胞色素B突变体143B杂交细胞对能再生NAD的电子受体具有自养性+**
（A） 143B CytB细胞的增殖速率是在丙酮酸盐存在或不存在的情况下测定的。（左）当应用培养基条件时，细胞计数标准化为t=0时的细胞数，随时间评估并用于计算增殖率（右）。（B）丙酮酸是乳酸脱氢酶（LDH）的底物，接受NADH的电子生成NAD+和乳酸。（C） α-酮丁酸（AKB）也可以作为NADH的电子受体，生成NAD+和α-羟基丁酸（AHB）。（D）在AKB存在或不存在的情况下，143B CytB细胞的增殖率如（A）所示。（E）在未经处理的培养基或丙酮酸（Pyr）或AKB存在的情况下，测定143B CytB细胞中NAD+/NADH的细胞内比率。（F）用GCMS分析法测定在AKB存在下培养的143B CytB细胞培养基中AKB和AHB的浓度。所有图形面板中的值表示平均值±标准误差（SEM），n=3。另请参见图S1。

**图2。外源电子受体恢复呼吸抑制细胞的增殖**
（A）在不添加（Untr）或存在线粒体呼吸抑制剂鱼藤酮（Rot）、苯甲酸（Phen）、抗霉素（Ant）、粘噻唑（Myxo）、叠氮化物（N_三)或寡霉素（Oligo）。（B）在143B细胞中测定NAD+/NADH的比率，如（A）所示，在没有或存在呼吸抑制剂的情况下，添加或不添加AKB。（C） A172、H1299、HeLa、U87、FL5.12和MEF细胞系的增殖率是在不存在或存在鱼藤酮、抗霉素或寡霉素的情况下，在补充或不补充AKB的情况下测定的。所有图形面板中的值表示平均值±SEM，n=3。另请参见图S2。

**图3。线粒体ATP缺乏时的氧气利用足以促进细胞增殖**
（A）图解说明寡霉素和FCCP对线粒体膜电位和ATP合成的影响。寡霉素治疗抑制ATP合成酶，导致线粒体膜超极化。这种超极化抑制质子泵，从而抑制ETC活性，从而降低NADH氧化和O₂消耗量（左）。除寡霉素外，FCCP治疗可缓解线粒体膜的超极化，从而恢复NADH氧化和线粒体O₂在没有恢复ATP生产的情况下消耗（右）。（B）在有或无FCCP处理的情况下，用寡霉素处理的143B细胞的增殖率。（C）用含或不含FCCP的寡霉素处理143B细胞的线粒体耗氧率。（D）在有或无FCCP的情况下，用寡霉素处理的143B细胞中的细胞内NAD+/NADH比率。所有图形面板中的值表示平均值±SEM，n=3（B，D），n=5（C）。

**图4。电子受体不足影响嘌呤核苷酸水平**
（A）通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析未添加AKB的143B CytB细胞的DNA含量。（B） LCMS定量测定在添加或不添加AKB的情况下培养的143B CytB细胞中的嘌呤核苷酸水平。（C）在未补充培养基或补充AKB、腺嘌呤、次黄嘌呤或鸟嘌呤的培养基中培养的143B CytB细胞，在一段时间内测量细胞加倍。（D） IMP用于GMP和AMP合成的示意图。GMP的合成需要NAD+，而AMP的合成需要天冬氨酸。（B）和（C）中的值表示平均值±SEM，n=3。另请参见图S3。

**图5。电子受体不足抑制TCA代谢物和天冬氨酸水平**
（A）详细说明了谷氨酰胺生物合成天冬氨酸的TCA循环反应路线的示意图。（B）添加AKB的143B CytB细胞和在U存在下培养的143B细胞天冬氨酸的等位体分布-¹³C谷氨酰胺8小时。（C） GCMS定量分析含或不含AKB培养的143B CytB细胞的TCA循环代谢物、谷氨酸和天冬氨酸。（D） GCMS对含有或不含AKB培养的143B细胞中的TCA代谢物、谷氨酸和天冬氨酸进行量化，无论是否存在指示的线粒体抑制剂。离子计数与未经处理的143B细胞有关，用每个面板中的灰色虚线表示。数值表示平均值±SEM，n=3。另请参见图S4。

**图6。天冬氨酸是呼吸提供的关键生物合成前体**
（A）在存在或不存在天冬氨酸的情况下测定143B CytB细胞的增殖率。（B）在线粒体呼吸抑制剂鱼藤酮（Rot）、二甲双胍（Phen）、抗霉素（Ant）、粘噻唑（Myxo）、叠氮化物（N_三)或寡霉素（Oligo）。（C）在鱼藤酮、抗霉素或寡霉素存在下培养的A172、H1299、HeLa、U87、FL5.12和MEF细胞的增殖率。（D）详细说明呼吸和外源电子受体在天冬氨酸生物合成中的作用的示意图。营养素转化为天冬氨酸需要去除电子，因此需要接触电子受体，而电子受体可以通过呼吸（O₂)或外源性电子受体，如AKB。天冬氨酸库的维持支持核苷酸和蛋白质的生物合成。所有图面板中的值表示平均值±SEM，n=3。另请参见图S5。

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