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.2015年7月30日；162(3):540-51.
doi:10.1016/j.cell.2015.07.016。

线粒体电子传递链在细胞增殖中的一个重要作用是促进天冬氨酸的合成

科凡·比尔索伊 1, 王铁卫 1, 沃尔特·W·陈 1, Elizaveta Freinkman公司 2, 月Abu-Remaleh 1, 大卫·M·萨巴蒂尼 三
附属公司

线粒体电子传递链在细胞增殖中的一个重要作用是促进天冬氨酸的合成

科凡·比尔索伊等。 单元格. .

摘要

线粒体电子传递链（ETC）能够实现许多代谢过程，但其抑制抑制细胞增殖的原因尚不清楚。也不清楚为什么补充丙酮酸能使缺乏ETC功能的细胞增殖。我们使用一个基于CRISPR的基因筛查来识别基因的缺失会使人类细胞对二甲双胍（一种复杂的I抑制剂）敏感。筛选产生GOT1，即细胞溶质天冬氨酸转氨酶，其丢失会在ETC抑制时杀死细胞。GOT1通常消耗天冬氨酸以将电子转移到线粒体中，但在ETC抑制后，它会在胞浆中反向生成天冬氨酸酯，部分补偿线粒体天冬氨酯合成的损失。丙酮酸以依赖GOT1的方式刺激天冬氨酸合成，这是丙酮酸拯救ETC功能障碍细胞增殖所必需的。天冬氨酸转运体的补充或过度表达可使无ETC活性的细胞增殖。所以，促进天冬氨酸合成是ETC在细胞增殖中的重要作用。

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数字

图1
图1。基于CRISPR的基因筛查可识别代谢基因，其缺失会使人类细胞对二甲双胍敏感
（A） 二甲双胍对Jurkat细胞增殖的剂量依赖性影响（平均值±SD，n=3）。（B） 基于CRISPR的汇总屏幕示意图。（C） 未经治疗与二甲双胍治疗（0.5 uM）Jurkat细胞的基因评分。基因得分是培养期间针对该基因的所有sgRNAs丰度的中位对数倍变化。大多数基因以及非靶向控制sgRNAs在有无二甲双胍的情况下得分相似。（D） 在苯乙双胍治疗后，得分为差异所需的前25个基因（顶部）。与GOT1催化的转氨反应相关的基因用红色表示，ETC用蓝色表示，与核苷酸生物合成相关的基因则用绿色表示。得分最高的基因GOT1催化天冬氨酸转氨为α-酮戊二酸，产生L-谷氨酸和草酰乙酸（OAA），并需要PLP作为辅助因子（底部）。（E） 在二甲双胍存在（灰色）或不存在（黑色）的情况下，单个GOT1 sgRNAs的初级筛查中的丰度变化。（F） 二甲双胍处理后，GOT1-完整细胞死亡。野生型和GOT1-null Jurkat细胞指示蛋白的免疫印迹分析（顶部）。Akt被用作装载控制。用指定浓度的二甲双胍处理5天后，野生型（黑色）和GOT1-非完整（蓝色）Jurkat细胞的细胞数（log2）的折叠变化（平均值±SD，n=3）（底部）。经过5天的二甲双胍治疗后，所示细胞的典型亮场显微照片（右）。（G） sgRNA-resistant GOT1 cDNA的表达可缓解GOT1-null Jurkat细胞对二甲双胍的敏感性。野生型、GOT1-null和挽救的空细胞的免疫印迹分析（顶部）。猛禽被用作装载控制。用指定的苯乙双胍浓度处理5天后，野生型（黑色）、GOT1-null（蓝色）和挽救的GOT1-null（灰色）细胞的细胞数（log2）的倍数变化（平均值±SD，n=3）（底部）。
图2
图2。ETC抑制杀死缺乏GOT1的细胞
（A） GOT1缺失使各种人类细胞类型对二甲双胍治疗敏感。野生型和GOT1-null Raji和KMS-26细胞的免疫印迹分析（左）。猛禽被用作装载控制。用指定的苯乙双胍浓度（平均值±SD，n=3）处理5天后，野生型（黑色）和GOT1-非完整（蓝色）KMS-26和Raji细胞的细胞数（log2）的倍数变化（右）。（B） 各种ETC抑制剂诱导的ETC功能障碍导致GOT1-空细胞死亡。图示了二甲双胍（复合物I抑制剂）、吡霉素（复合物Ⅰ抑制剂）和抗霉素（络合物Ⅲ抑制剂）的作用（左）。用指示的吡霉素和抗霉素浓度（平均值±标准偏差，n=3）处理5天后，野生型（黑色）、GOT1-null（蓝色）和挽救的GOT1-nurl（灰色）Jurkat细胞的细胞数（log2）的倍数变化（右）。
图3
图3。ETC抑制后，GOT1逆转并生成天冬氨酸，限制细胞增殖
（A） 苹果派航天飞机示意图。正常情况下，马来酸盐穿梭器向前运行，将还原当量传递到线粒体膜上。GOT1是苹果酸-天冬氨酸穿梭器的一部分，它消耗天冬氨酸酯生成草酰乙酸（OAA）。线粒体产生的天冬氨酸是蛋白质和核苷酸生物合成的前体。（B） 在ETC抑制后，GOT1逆转并消耗天冬氨酸。使用（灰色）或不使用（黑色）二甲双胍治疗24小时后，野生型和GOT1-null Jurkat细胞中指示氨基酸的相对丰度（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。所有测量均与未经处理的野生型Jurkat细胞有关。（C） Tfam基因敲除心脏的天冬氨酸与亮氨酸的比率低于野生型心脏。野生型和TFAM-null小鼠心脏中TFAM和COXI的免疫印迹分析（左）。S6K1被用作加载控制。野生型和TFAM-null小鼠心脏中天冬氨酸与亮氨酸的相对比率（平均值±SD，n=7（野生型）和n=6（TFAM null），**p<0.05）。（D） 补充天冬氨酸可挽救ETC抑制后GOT1缺失细胞的死亡。用所示的苯乙双胍浓度治疗5天后，在不存在和存在天冬氨酸（10 mM）的情况下，野生型（黑色）、GOT1-null（蓝色）和挽救的GOT1-null（灰色）Jurkat细胞的细胞数（log2）的折叠变化（平均值±SD，n=3，**p<0.05）（顶部）。在不含或含有天冬氨酸的情况下，使用二甲双胍治疗5天后，所示细胞的典型亮视野显微照片（下图）。（E） 谷氨酸-天冬氨酸转运体（SLC1A3）的表达可挽救在标准RPMI培养基中培养的GOT1-完整细胞因二甲双胍诱导的死亡，该培养基仅含有150μM天冬氨酸酯。用10μM苯甲酸钠治疗5天后，RPMI（150μM天门冬氨酸）中GOT1-null（蓝色）和SLC1A3-过度表达GOT1-null（灰色）Jurkat细胞的细胞数（log2）的折叠变化（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。
图4
图4。ETC抑制细胞中天冬氨酸合成的代谢途径
（A） 谷氨酰胺氧化和还原代谢途径示意图（顶部）。绿色和蓝色箭头分别表示TCA循环的氧化臂和还原臂。实心圆表示13C原子来源于[U-13C] -L-谷氨酰胺。（B） ETC抑制后，天冬氨酸主要通过谷氨酰胺的还原代谢以GOT1依赖的方式合成。用[U-13C] -存在或不存在二甲双胍的L-谷氨酰胺（10 uM）。每个样品的天冬氨酸池大小（中间）和从标记的谷氨酰胺中衍生的标记的天冬酰胺部分（底部）在单独的图表中显示（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。OAA，草酰乙酸。
图5
图5。在ETC抑制的细胞中，丙酮酸以GOT1依赖方式刺激天冬氨酸合成
（A） 丙酮酸不能挽救ETC抑制剂诱导的GOT1-null细胞死亡。用二甲双胍（10 uM）、抗霉素（1 uM）和吡菌素（1μM）治疗5天后，在有或无丙酮酸（1 mM）的情况下，野生型（黑色）和GOT1-全（蓝色）Jurkat细胞的细胞数（log2）的折叠变化（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。（B） 在ETC抑制的细胞中，丙酮酸的添加以GOT1依赖的方式增加细胞天冬氨酸水平。在使用LC-MS/MS进行24小时苯甲酸（10 uM）治疗后，在存在或不存在丙酮酸的情况下，在野生型（黑色）、GOT1-null（蓝色）和挽救的GOT1-nurl（灰色）Jurkat细胞中测量相对天冬氨酸水平（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。所有测量均与未经处理的野生型Jurkat细胞有关。（C） 提出了丙酮酸介导的ETC抑制细胞增殖拯救机制。
图6
图6。具有ETC抑制的细胞需要丙酮酸的MDH1来刺激天冬氨酸的合成并使其增殖
（A） 丙酮酸盐不能挽救经苯乙双胍处理的MDH1无效细胞的增殖。野生型和MDH1-null Jurkat细胞以及表达sgRNA-resistant MDH1 cDNA的对应细胞的免疫印迹分析（左）。mTOR和猛禽用作装载控制。在存在或不存在丙酮酸盐（1 mM）的情况下，用苯乙双胍（10 uM）、吡霉素（1 uM）和抗霉素（1uM）治疗5天后，野生型（黑色）、MDH1-非完整型（浅蓝色）和挽救的MDH1-完整型（灰色）Jurkat细胞数的相对折叠变化（平均值±SD，n=3）（右）。（B） 丙酮酸诱导的天冬氨酸合成增加取决于MDH1。在24小时二甲双胍（10 uM）治疗后，在存在或不存在丙酮酸（1 mM）的情况下，测定野生型（黑色）、GOT1-非完整型（蓝色）和MDH1-非完整（浅蓝色）Jurkat细胞中的相对天冬氨酸水平（平均值±标准偏差，n=3）。所有测量均与未经处理的野生型Jurkat细胞有关。（C） 在ETC抑制下丙酮酸诱导天冬氨酸合成的代谢途径。丙酮酸通过乳酸脱氢酶在细胞质中再生NAD+。这种NAD+可以激活细胞质苹果酸脱氢酶，从苹果酸中提供OAA，并通过GOT1驱动天冬氨酸合成。或者，OAA的另一个来源是通过ATP-柠檬酸裂解酶，该酶催化柠檬酸和辅酶A在胞浆中转化为乙酰辅酶A和OAA。在ETC抑制下，后一反应可能对NAD+的依赖性较小，即使在没有丙酮酸补充的情况下也能起作用。注意，这两种途径都依赖于GOT1。（D） 天冬氨酸水平与ETC抑制后的细胞健康相关。ETC抑制导致天冬氨酸水平降低，并抑制野生型细胞的细胞增殖。GOT1产生的剩余天冬氨酸足以维持生存能力，因为GOT1缺失会导致细胞死亡，对应于天冬氨酸类物质几乎完全耗尽。添加丙酮酸以依赖GOT1和MDH1的方式在ETC抑制下拯救天冬氨酸水平和增殖。
图7
图7。补充天门冬氨酸能够使具有线粒体DNA突变的患者衍生杂交细胞增殖，并取代对丙酮酸的需要
（A） 天冬氨酸可以取代丙酮酸，使患者衍生的mtDNA突变杂交和143Bρ0缺乏线粒体DNA的细胞。ETC功能障碍的细胞系模型在含有丙酮酸（1 mM）或天冬氨酸（10 mM）的RPMI（补充50 ug/ml尿苷以绕过尿苷合成中对复合物III的需要）中培养6天。通过归一化到补充丙酮酸的条件来确定相对细胞数。MERRF、CYTB和143Bρ的典型亮场显微照片0在指定条件下（右侧）培养6天后的细胞（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。（B） 丙酮酸刺激ETC功能障碍的杂交细胞中天冬氨酸的生物合成。用[U-13C] -存在或不存在丙酮酸（1 mM）时的L-谷氨酰胺。[U标记天冬氨酸的分数-13C] -显示L-谷氨酰胺（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。OAA，草酰乙酸。（C） 补充丙酮酸能够使患者衍生的杂交细胞以依赖GOT1的方式增殖，天冬氨酸可以绕过这种方式。表达sgControl和sgGOT1的野生型、MERRF和CYTB杂交细胞的免疫印迹分析（上图）。猛禽被用作装载控制。表达sgControl或sgGOT1的ETC功能障碍细胞系模型在添加或不添加天冬氨酸（10 mM）的RPMI（补充尿苷（50 ug/ml）和丙酮酸（1 mM））中培养6天（底部）。通过标准化sgControl表达细胞系来确定相对细胞数（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。（D） SLC1A3过表达使CYTB细胞能够在不添加丙酮酸盐的标准RPMI培养基中增殖。当在缺乏天冬氨酸和丙酮酸盐（蓝色）或补充天冬氨酸（150μM）（黑色）或丙酮酸盐（1 mM）（灰色）的RPMI培养基中培养时，143B野生型、CYTB cybridge细胞及其表达SLC1A3的对应物的细胞数随时间的倍数变化（平均值±SD，n=3，**p<0.05）。
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