Integrative miRNA and Gene Expression Profiling Analysis of Human Quiescent Hepatic Stellate Cells

doi:10.1038/srep11549

.2015年6月22日：51549。

doi:10.1038/srep11549。

人静止肝星状细胞miRNA整合及基因表达谱分析

附属公司

¹西班牙巴塞罗那生物研究所August Pi i Sunyer（IDIBAPS）。
²比利时布鲁塞尔Vrije Universiteit Brussel（VUB）医学院肝细胞生物学实验室。
^三西班牙巴塞罗那生物研究中心（CIBERehd）。
⁴比利时布鲁塞尔鲁汶天主教大学实验与临床研究所小儿肝病与细胞治疗实验室。
⁵1] 西班牙巴塞罗那生物研究所August Pi i Sunyer（IDIBAPS）[2]西班牙巴塞罗纳生物研究中心（CIBERehd）[3]西班牙巴塞罗那州巴塞罗那大学医学院Clinic医院肝脏科。
⁶1] 西班牙巴塞罗那生物研究所（IDIBAPS），巴塞罗那[2]生物研究中心（CIBERehd），西班牙巴塞罗纳[3]生物研究中心。

PMID： 26096707
PMCID公司：项目经理4476106
内政部： 10.1038/srep11549

人静止肝星状细胞miRNA整合及基因表达谱分析

马尔·科尔等。科学代表. 2015.

.2015年6月22日：51549。

doi:10.1038/srep11549。

附属公司

¹西班牙巴塞罗那生物研究所August Pi i Sunyer（IDIBAPS）。
²比利时布鲁塞尔Vrije Universiteit Brussel（VUB）医学院肝细胞生物学实验室。
^三西班牙巴塞罗那生物研究中心（CIBERehd）。
⁴比利时布鲁塞尔鲁汶天主教大学实验与临床研究所小儿肝病与细胞治疗实验室。
⁵1] 西班牙巴塞罗那生物研究所August Pi i Sunyer（IDIBAPS）[2]西班牙巴塞罗纳生物研究中心（CIBERehd）[3]西班牙巴塞罗那州巴塞罗那大学医学院Clinic医院肝脏科。
⁶1] 西班牙巴塞罗那生物研究所（IDIBAPS），巴塞罗那[2]生物研究中心（CIBERehd），西班牙巴塞罗纳[3]生物研究中心。

PMID： 26096707
PMCID公司：项目经理4476106
内政部： 10.1038/srep11549

摘要

揭示维持肝星状细胞（HSC）静止（q）表型的调控途径对于开发治疗纤维原性疾病的新治疗策略至关重要。为了揭示qHSC中miRNA-mRNA的调节相互作用，HSC是从健康肝脏中提取的FACS，并在体外生成活化HSC（aHSC）。MiRNA-Taqman阵列分析显示HSC表达少量miRNAs（n=259），其中47个表达下调，212个表达上调。miRNA和基因表达谱的计算整合表明，66%的qHSC-相关miRNA与6个以上的改变靶mRNA相关（17,28±10,7靶/miRNA），而aHSC-关联miRNA平均有1.49个靶基因。有趣的是，qHSC中miRNA靶向基因产生的相互作用网络与关键HSC激活过程相关。接下来，在健康和肝硬化人类肝脏中验证选定的miRNAs，并选择miR-192进行功能分析。在小鼠肝损伤模型的纤维化进展过程中，发现HSC中miR-192的下调是早期事件。此外，对HSC中miR-192的模拟分析揭示了其在HSC激活、增殖和迁移中的作用。总之，这些结果揭示了miRNAs在维持qHSC表型中的重要性，并为理解HSC的调控网络奠定了基础。

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数字

**图1。分选细胞群和培养肝星状细胞的纯度：**
(A类)肝细胞的相对表达(*白蛋白*)、HSC(*PDGFRB公司*)和LSEC(*CD32b型*)qHSC、LSEC和肝细胞样本中的标记物（n=3；每组）。(B类)肝细胞标记物的相对表达(*PDGFRB公司*,*CD32b型*和*80层/四层*)，激活标记(*ACTA2、COL1A1和LOX*)连同静止标记(*SPARCL1，ATP1B2*)在非实质部分（NFP）、nycodenz-qHSC部分（NYCO）和aHSC中（传代4）。

**图2。人类静止HSC的MiRNA表达谱。**
热图显示新分离的qHSC与各自培养激活的HSC中差异表达的miRNAs（每组4个）。miRNA表达数据通过执行Taqman人类miRNA阵列生成。每种颜色的强度表示所有样本中每个miRNA的强度和平均表达之间的标准化比率。红色像素表示所示样品中miRNA的丰度增加，而绿色像素表示Log2标度中miRNA水平降低。在人类静止状态下，与*在体外*表中总结了激活的HSC。

**图3。MiRNA-mRNA综合分析。**
(A类)miRNA-mRNA整合分析工作流程。该图显示了通过整合miRNA和基因表达数据实现的miR-192潜在mRNA靶点的减少：首先，miR-192的靶点与Microosm数据库预测的靶点相连；第二，miR-192与Microcosm预测的靶点相关，并且在人类HSC激活过程中也发现其被解除调控（p<0.01），最后，基于miR-192s与其预测靶点之间的显著负相关和Microcosm预测值，显示了功能相关的miR-192-靶点(B类)根据miRNA-基因整合分析指定的解除管制的靶基因数量，代表差异表达的miRNAs的直方图（p<0.01）。红色条表示miRNAs在qHSC中高表达，而绿色条表示miRNA在激活的HSC中高度表达。

**图4。肝硬化和健康人肝脏中的MiRNA表达水平。**
(A类)肝硬化（n=14）和健康（n=15）人类肝脏样本中富含qHSC的miRNAs的表达水平。(B类)肝硬化（n=15）和健康（n=14）人类肝脏样本中富含aHSC的miRNAs的表达水平。

**图5。体外调节LX2细胞中miRNA-21、miRNA-100和miRNA-192的表达。**
通过分别转染miR-21 antagomir（50 nM）、miR-100 antagomir50 nM或miR-192模拟物50 nM（n=3），可以降低LX2细胞中miR-21和miR-100的表达，上调miR-192。(A类)方框图显示miRNA与靶基因表达之间存在显著的负相关。MiR-21和MiR-100抑制导致其靶基因的表达水平增加，而MiR-192过度表达则降低靶基因表达水平(B类)体外miR-21、miR-100和miR-192表达的调节导致HSC活化减少。

**图6。miR-192在原代小鼠HSC中的表达和功能。**
(A类)miR-192在小鼠HSC中的表达体内激活。从对照小鼠、CCl治疗小鼠分离的HSC中评估Mir-192的表达水平₄以及在治疗或手术后的指定时间点进行BDL或sham-operation后的小鼠。与对照组或假手术组小鼠相比，miRNA表达增加。(B类)miR-192在从健康小鼠肝脏分离的不同类型肝细胞中的表达。通过qPCR评估肝细胞、静止肝细胞和正常肝细胞中MiR-192的表达*在体外*激活HSC、KC和LSEC。Mir-192的表达与整个肝脏相关(C类)miR-192过表达对原代小鼠HSC细胞活化、迁移和增殖的影响。在miR-192模拟转染后1天，在转染小鼠HSC中评估miR 192对HSC增殖的贡献。HSC暴露于EdU，2天后固定并染色以检测DNA结合EdU。增殖以EdU阳性细胞的百分比表示。通过对转染模拟miR-192的原代小鼠HSC进行跨阱迁移实验，评估miR-192.对小鼠HSC迁移的贡献。添加PDGFbb（20 ng/mL）以促进细胞迁移。18小时后，用DAPI对迁移的细胞进行染色并计数。结果表示为相对于非PDGF刺激细胞的迁移。最后，通过将新鲜分离的小鼠HSC暴露于TGFβ1（10 ng/mL）或溶剂中48小时，评估过表达miR-192对细胞激活的影响。结果表示为与溶剂孵育的miR对照的相对表达。

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1. Friedman S.L.肝星状细胞：肝脏的变形、多功能和神秘细胞。生理学。第88版，第125–172页（2008年）。-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Bataller R.&Brenner D.A.肝纤维化。临床杂志。投资。115, 209–218 (2005).-项目管理咨询公司-公共医学
1. Grimson A.等人，《哺乳动物的微RNA靶向特异性：种子配对以外的决定因素》，《分子细胞》27，91–105（2007）。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Wang X.W.、Heegaard N.H.H.和Orum H.肝脏疾病中的微RNA。《胃肠病学》1421431-1443（2012）。-项目管理咨询公司-公共医学

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[7] Grimson A.等人，《哺乳动物的微RNA靶向特异性：种子配对以外的决定因素》，《分子细胞》27，91–105（2007）。-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Grimson A.等人，《哺乳动物的微RNA靶向特异性：种子配对以外的决定因素》，《分子细胞》27，91–105（2007）。-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Wang X.W.、Heegaard N.H.H.和Orum H.肝脏疾病中的微RNA。《胃肠病学》1421431-1443（2012）。-项目管理咨询公司-公共医学

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