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。2014年8月12日4时41分。
doi:10.1186/2045-3701-4-41。 2014年电子收集。

Pinocembrin通过失活αvβ3整合素/FAK/p38α信号通路抑制TGF-β1诱导的人Y-79视网膜母细胞瘤细胞上皮间质转化和转移

陈坤翔 1, 奚明德 2, Chi-Sheng Chien先生 三, 袁伟世 4
附属公司

Pinocembrin通过失活αvβ3整合素/FAK/p38α信号通路抑制TGF-β1诱导的人Y-79视网膜母细胞瘤细胞的上皮-间质转化和转移

陈坤翔等。 细胞生物学。 。

摘要

背景：蜂胶中最丰富的黄酮类化合物是松茸素。在本研究中，我们研究了松属素对TGF-β1诱导的人Y-79视网膜母细胞瘤细胞上皮-间充质转化（EMT）和转移的抗转移作用。

结果：首先，研究结果表明，在非细胞毒性浓度下，松柏素显著抑制TGF-β1诱导的Y-79细胞侵袭和迁移能力。Pinocembrin降低TGF-β1诱导的Y-79细胞波形蛋白、N-钙粘蛋白、αv和β3整合素的表达。分子数据还显示，松属素抑制TGF-β1诱导的基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/-9）的酶活性、蛋白和信使RNA水平下调所涉及的黏着斑激酶（FAK）和p38α信号的激活。其次，松霉素还强烈抑制κBα抑制剂（IκB a）的降解和核因子κB（NF-κB）的核水平。此外，在松柏素处理下，进一步观察到对NF-κB结合能力的剂量依赖性抑制。

结论：研究结果表明，松柏素通过灭活αvβ3整合素/FAK/p38α信号通路，抑制TGF-β1诱导的上皮-间充质转化（EMT）和Y-79细胞的转移。因此，我们的研究结果表明松霉素对视网膜母细胞瘤细胞具有抗癌潜力。

关键词：入侵；迁移；松胚蛋白；转化生长因子-β1；αv和β3整合素。

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数字

图1
图1
松属素对Y-79细胞活力和生长的影响。（A）松脂素的化学结构。（B）培养的细胞在不同浓度（0、5、10、20、40、60、80和100μM）下用或不用皮诺伞蛋白处理24小时。此后，用MTT法测定细胞活力。（C）细胞固定并用PI染色，然后用流式细胞仪（FACS）分析细胞周期分布。（D）使用或不使用药物（10 ng/ml TGF-β1和5μM松脂蛋白）处理细胞24 h，并通过MTT法测定细胞活力。值代表三个独立实验的平均值±SD(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001，与未经治疗的对照组（剂量0）相比。
图2
图2
松霉素对TGF-β1诱导的Y-79细胞的细胞基质粘附、侵袭、迁移和上皮-间充质转化的抑制作用涉及αvβ3整合素的激活用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80 nM环RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理Y-79细胞30分钟，然后用10 ng/ml TGF-β1在5μM松柏素存在或不存在的情况下刺激24小时，然后按照方法中的描述进行细胞-基质粘附分析。（B）在侵袭试验中，用5μg/ml抗αvβ3单克隆抗体（mAb）或80 nM环RGD肽（cyclo-RGDfV）预处理细胞30分钟，然后在有或无5μM松柏素的情况下用10 ng/ml TGF-β1刺激细胞24小时。然后用transwell检测8小时的侵袭力；聚碳酸酯过滤器（孔径为8μm）预涂有基质凝胶。培养8小时后，固定过滤器底部的细胞，染色并计数。（C）使用聚碳酸酯过滤器，通过transwell测量6小时的迁移分析。培养6小时后，固定过滤器底部的细胞，染色并计数。（D）用TGF-β1（10 ng/ml）在不含或含有5μM松属素的情况下预处理细胞0、30、60、120、180 min，然后用Western blotting法用抗E-钙粘蛋白、抗N-钙粘素、抗波形蛋白和抗β-肌动蛋白抗体测定细胞溶解物提取物，如方法所述。值代表三个独立实验的平均值±SD(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001与仅TGF-β1治疗相比）。
图3
图3
松属素对TGF-β1诱导的Y-79细胞整合素水平的抑制作用。（A）用TGF-β1（10 ng/ml）对细胞进行预处理，然后在不同浓度的松属素（0、1、2.5和5μM）中培养6 h，并分析整合素。（B）用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞，然后在5μM松脂蛋白中培养不同时间长度（0、30、60、120和180分钟），然后分析整合素。（C）流式细胞术检测整合素的表达。数值表示为三个独立实验的平均值±标准差。*第页 < 0.05时**第页 < 0.01,***第页 < 0.001，与0h处理时间相比。
图4
图4
松霉素对TGF-β1诱导的Y-79细胞活性和MMP-2/-9表达的抑制作用。用TGF-β1（10 ng/ml）对无血清培养基中培养的细胞进行预处理，然后在不同浓度的松属素（0、1、2.5和5μM）中培养。（A）收集条件培养基，通过明胶酶谱测定MMP-2/-9活性。（B）Western blotting分析MMP-2/-9蛋白表达。（C）用RT-PCR分析MMP-2/-9 mRNA的表达。采用β-肌动蛋白和GADPH作为内部控制。
图5
图5
松属素对TGF-β1诱导的Y-79细胞FAK/p38α磷酸化的抑制作用。（A和B）用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞2 h，然后在5μM pinocembrin持续0、1、2、3和6小时。通过Western blotting测定FAK（Tyr397、Tyr576、Tyr 925）、Smad2、JNK1/2、ERK1/2、p38α的总蛋白和磷酸化水平。β-肌动蛋白被用作内部控制。
图6
图6
松属素对TGF-β1诱导的NF-κB转录活性/NF-κ子B/IκBα磷酸化和降解的抑制作用。（A）用TGF-β1（10 ng/ml）预处理细胞2 h，然后用5μ如方法中所述，0、1、2、3和9小时的松脂蛋白，以及通过荧光素酶报告基因分析的NF-κB转录活性。（B）对核提取物进行SDS-PAGE，然后用特异性抗体（抗NF-κB p50、抗NF-kb p65、抗p-IκBα、抗IκBα）进行Western blotting。采用C23和β-actin作为内部对照。（C）EMSA测定的NF-κB DNA结合活性，如方法所述。通道1：核提取物与100倍多余的未标记共识寡核苷酸（comp.）孵育，以确认结合特异性。通道2表示不含TGF-β1（阴性对照）的Y-79细胞的核提取物。数值代表三个独立实验的平均值±SD。(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01,***第页 < 0.001与仅TGF-β1治疗相比）。
图7
图7
提出了pinocembrin抑制TGF-β1诱导的人Y-79细胞上皮-间充质转化和转移的机制。松果体蛋白通过avβ3整合素受体抑制TGF-β1作用，激活FAK和p38α，导致IκBα磷酸化，NF-κB（p50和p65）活化，核移位，NF-kb B与MMP-2/MMP-9启动子结合位点结合，MMP-2/MMP-9基因表达启动，并有助于抑制细胞EMT和转移。
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