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.2015年4月28日4:4:e07739。
doi:10.7554/eLife.07739。

MICOS与呼吸复合物和脂质协调以建立线粒体内膜结构

乔纳森·弗里德曼 1, 阿诺德·穆里埃 2, 贾斯汀·山田 1, J迈克尔·麦卡弗里 三, 乔迪·努纳里 1
附属公司

MICOS与呼吸复合物和脂质协调以建立线粒体内膜结构

乔纳森·弗里德曼等。 埃利夫. .

摘要

保守的MICOS复合体是线粒体内膜结构的主要决定因素。我们讨论了MICOS的组织和功能作用，并确定了两个独立的MICOS亚复合物：Mic27/Mic10/Mic12，其组装依赖于呼吸复合物和线粒体脂质心磷脂，以及Mic60/Mic19，其组装独立于这些因素。我们的数据表明，MICOS亚复合物独立地定位于嵴连接，并通过Mic19连接，Mic19起到调节亚复合物分布的作用，因此也可能是嵴连接拷贝数。MICOS亚单位具有非冗余功能，因为两个MICOS子复合物的缺失会导致比单个MICOS亚基或亚复合物缺失更严重的形态和呼吸生长缺陷。MICOS丢失导致的线粒体缺陷是由呼吸复合物在内膜中的错误分布引起的。总之，我们的数据与MICOS、线粒体脂质和呼吸复合物协同构建功能性且形状正确的线粒体内膜的模型一致。

关键词：MICOS；酿酒酵母；心磷脂；细胞生物学；嵴；线粒体；呼吸复合物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

JN：审阅编辑器，电子生活。在Mitobridge的科学咨询委员会上，并宣布与这项工作无关的经济利益。

其他作者声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1。
图1.MICOS复合物是氧化磷酸化和正常线粒体超微结构和形态所必需的。
(A类)将所示酵母细胞的一系列稀释液接种在含有葡萄糖（左）和不可发酵碳源甘醇（右）的培养基上。(B)通过表达基质标记物mito-dsRed的成像细胞测定所示菌株的线粒体形态。共聚焦荧光图像的Z投影如图所示，但∆MICOS的右面板除外，它是一个平面。(C类)图像中细胞线粒体形态的量化(B)已分类。对来自三个独立实验的大约100个细胞进行了量化，数据表示为平均值±SEM(D类)所示菌株的化学固定酵母细胞的典型电子显微镜图像。(E类)显示了表达mito-DsRed和功能性核仁标记Rim1-GFP的指示菌株的细胞的共焦荧光显微镜z投影。箭头表示∆MICOS细胞中Rim1-GFP的聚集。比例尺：(B)2微米；(D类)500纳米；(E类)3微米。另请参见图1-图补充1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.003
图1-图补充1。
图1——图补充1。Rim1是类核的功能标记。
(A类)野生型酵母和表达Rim1-GFP的酵母的系列稀释液trp1型在含有葡萄糖（左）和非发酵碳源glyercol（右）的培养基上进行定位。(B)野生型rho共焦荧光显微图像的Z投影+（顶部）和rho0（底部）表达Rim1-GFP和线粒体基质标记物mito-DsRed的细胞。比例尺：3μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.004
图2。
图2.Mic60独立自组装，其内膜分布由Mic19调节。
(A类)代表性去卷积荧光显微镜图像的Z投影显示了野生型酵母细胞表达所示的整合GFP标记的MICOS蛋白和mito-DsRed。黄色框表示下面插图中所示的单元格区域。插图显示单个平面。(B)典型图像如所示(A类)对于表达指示的GFP标记的MICOS蛋白的∆MICOS细胞，在其内源性基因座处重新整合。箭头标记了Mic60定位到焦点的位置。(C类)Mic60-EGFP在∆MICOS细胞中的分布测定如下：(B)表明未标记的MICOS蛋白在其内源性位点重新整合。(D类)用所示抗体进行的代表性Western blot分析显示，来自表达Mic60-FLAG或Mic60-EGFP的∆MICOS细胞的全细胞裂解物（左侧面板）和免疫沉淀洗脱物（IP；右侧面板）微型计算机60位点，如有指示，表达来自尿酸3轨迹使用MIC60话筒启动子（pMic60-EGFP）。G6PDH抗体作为负荷对照。使用所示抗体进行IP。星号表示一条与IgG重链大小一致的带。(E类)用从表达Mic60-EGFP的野生型（左）或∆MICOS（右）细胞中分离的洗涤剂溶解线粒体的总（T）、上清液（S）和不溶性（P）部分的指示抗体进行Western blot分析，并在50000×克持续1小时，颗粒大小为60S及以上的颗粒。(F类)图中显示了无和有Mic19表达的∆MICOS细胞中具有可检测Mic60病灶的细胞百分比，如(B)和(C类). 对来自三个独立实验的大约75个细胞进行了量化，数据表示为平均值±SEM(G公司)表中描述了使用来自∆MICOS细胞裂解液的FLAG抗体进行纯化和质谱分析的指示蛋白质（顶部）的总光谱数和蛋白质覆盖率，该细胞裂解液表达了在其内源性位点表达的Mic60和Mic19的指示组合（左）。所示数据是两个独立实验的平均值。比例尺：(A类–B)3微米；(C类)2微米。另请参见图2-图补充1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.005
图2——图补充1。
图2补充图1。Mic60的过度表达不会改变其在∆MICOS细胞中的定位。
表达mito-DsRed和Mic60-EGFP的∆MICOS细胞内源性位点（左）或Mic60-FLAG的共聚焦荧光显微镜z投影MIC60话筒基因座和pMic60-EGFP由尿酸3轨迹（右）。箭头标记焦点Mic60的位置。比例尺：3μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.006
图3。
图3.Mic10、Mic12和Mic27构成一个独立的MICOS子复合体。
(A类)共焦荧光显微镜z投影如∆所示微型计算机60表达GFP标记的MICOS蛋白的细胞在其内源性位点和线粒体基质标记物mito-DsRed上表达。所示箭头表示Mic27和Mic12的焦距定位。(B)与基质标记物mito-GFP相比，Mic27-mCherry在显示的MICOS缺失细胞中的定位通过共焦荧光显微镜测定，如(A类). 箭头标记了Mic27焦点的示例。(C类)图像如所示(A类)对于表达Mic27-EGFP的∆MICOS细胞和在其内源性位点表达的未标记MICOS蛋白。箭头标记Mic27焦点。(D类)显示单元格百分比量化的图形，如(C类)每个细胞具有指定数量的Mic27-EGFP焦点。对来自三个独立实验的大约75个细胞进行了计数，显示的数据表示为平均值±SEM(E类)图像如所示(B)用于指示的酵母细胞。(F类)量化如中所示(D类)对于中所示的单元格(E类). (G公司)描绘通过质谱法从∆的裂解物中识别的指示MICOS蛋白质的总光谱计数数的图表麦克风60用GFP抗体纯化Mic27-EGFP的野生型细胞。所示数据是两个独立实验的平均值和范围。比例尺：(A类,B)2微米；(C类,D类)3微米。另请参见图3-源数据1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.007
图4。
图4 Mic27组件标记嵴连接。
(A类)表达Mic60-EGFP的（左）∆MICOS细胞共焦荧光显微镜图像的Z投影MIC60话筒基因座和线粒体-DsRed或（右）∆麦克风60在其内源性位点表达Mic27-mCherry和mito-GFP的细胞。细胞为rho+或rho0如有指示。(B)细胞数量(A类)如图所示，表示具有可检测Mic60或Mic27病灶的细胞数量。对来自三个独立实验的大约75个细胞进行了计数，所显示的数据表示为平均值±SEM+Mic60和Mic27的电池分别从图2F和3F中重新显示。(C类)描绘通过质谱法从∆裂解物中识别的指示MICOS蛋白质的总光谱计数数的图表麦克风60ρ+和rho0来自用GFP抗体纯化的Mic27-EGFP的细胞相对于野生型细胞。显示的数据是两个独立实验的平均值和范围以及rho的数据+从图3G中重新显示单元格。(D类)0.4µm台阶至∆的单平面共焦荧光显微镜图像麦克风60在其内源性位点表达Mic27-EGFP和复合物III标记Qcr2-mCherry的细胞以及线粒体基质标记mito-TagBFP。箭头表示在(E类). (E类)顶行：单个通道和中所示单元格的最大z投影图像的合并图像(D类). 最下面一行：从左到右，追踪线粒体，Qcr2信号高于ImageJ的“Moments”算法检测到的阈值，z投影中识别出的Mic27病灶，以及一幅合并图像，显示Qcr2阳性信号的线粒体周长区域及其相对于Mic27灶的位置。(F类)定量分析Qcr2信号阳性的线粒体周长总百分比，以及位于线粒体亚区Qcr2阳性细胞的Mic27病灶数量(E类)图4和补充图4。比例尺：(A类)3微米；(D类–E类)1微米。另请参见图4-图补充1-5和图4-源数据1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.009
图4-图补充1。
图4：图补遗1.稳定态Mic27表达水平维持在∆中麦克风60ρ0细胞与rho的比较+细胞。
对从内源性位点表达Mic27-mCherry并用mCherry抗体检测的指示菌株制备的全细胞裂解物进行Western blot分析。G6PDH用作负荷控制。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.011
图4——图补充2。
图4补充图2。单个呼吸复合物对Mic27病灶的形成并不重要。
(A类)从内源性位点表达mito-GFP和Mic27-mCherry的指示酵母细胞的共焦荧光显微镜图像的Z投影。(B)定量显示细胞中具有可检测Mic27病灶的细胞百分比，如(A类). 所示数据表示为三个独立实验的平均值±SEM，每个实验约计数75个细胞。∆数据麦克风60单元格从图3F中重新显示。比例尺：3μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.012
图4-图补充3。
图4补充图3。Qcr2和Atp2分别是复合物III和V的功能标记，定位于∆中的线粒体亚区麦克风60细胞。
(A类)在含有葡萄糖（左）和非发酵碳源glyercol（右）的培养基上，对表达其内源性位点所示标记的酵母细胞进行连续稀释。(B)表达丝裂原-GFP的野生型酵母细胞以及分别在其内源性位点表达的Qcr2-mCherry（左）或Atp2-mCherry（右）的共焦荧光显微镜z投影。(C类)如中所示(B)对于∆麦克风60细胞。(D类–E类)左：单个通道和∆的合并图像麦克风60表达mito-TagBFP以及Qcr2-mCherry和Atp2-EGFP的细胞在其内源性位点表达。右：左侧所示单元0.4µm步长的单平面图像。比例尺：(B,C类)3微米；(D类,E类)1微米。内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.013
图4——补充图4。
图4补充图4。Mic27组件位于嵴标记Qcr2附近。
(A类–N个)左图：∆共焦荧光显微镜图像的z投影示例麦克风60表达mito-TagBFP、Mic27-EGFP和Qcr2-mCherry的细胞从其内源性位点表达。右：线粒体周长（蓝色）、周长Qcr2阳性区域（红色）和Mic27病灶（绿色）的轨迹（如图4E所示）。(O（运行）)量化线粒体周长、Qcr2阳性周长、已识别的Mic27病灶数量以及与Qcr2信号相邻的Mic27-病灶数量，如所示(A类–N个)和图4E。比例尺：1μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.014
图4——补充图5。
图4-图补充5.Mic27组件位于嵴标记Atp2附近。
(A类–B)左：∆的单个通道和合并图像麦克风60表达mito-TagBFP以及Atp2-mCherry和Mic27-EGFP的细胞在其内源性位点表达。右：左侧所示单元0.4µm步长的单平面图像。箭头指示Mic27焦点的位置。比例尺：1μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.015
图5。
图5.为了Mic10/Mic12/Mic27亚复合物的稳定性，需要心磷脂。
(A类)图像显示了显示的细胞从其内源性位点和mito-DsRed表达Mic27-EGFP的共焦荧光显微镜z投影。(B)量化指示细胞中具有可检测Mic27病灶的细胞百分比。所示数据表示为三个独立实验的平均值±SEM，每个实验约计数75个细胞。(C类)描绘通过质谱法从∆的裂解物中识别的指示MICOS蛋白质的总光谱计数数的图表crd1型和∆麦克风60∆crd1型用GFP抗体纯化Mic27-EGFP的野生型细胞。(D类)在含有葡萄糖（左）和非发酵碳源glyercol（右）的培养基上连续稀释所示酵母细胞。(E类)对来自所指示的表达mito-DsRed的细胞的线粒体形态的定量进行分类。对来自三个独立实验的大约75–100个细胞进行了量化，数据表示为平均值±SEM。野生型和∆MICOS细胞的数据在图1C中重新显示。比例尺：3μm。另请参见图5——图补充1和图5——源数据1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.016
图5——图补充1。
图5-图补充1。心磷脂合成和MICOS之间的相互作用。
(A类)对从内源性位点表达Mic27-EGFP并用GFP抗体检测的指示菌株制备的全细胞裂解物进行Western blot分析。G6PDH用作负荷控制。(B)表达丝裂原-DsRed和Mic60-EGFP的酵母细胞共焦荧光显微镜图像的Z投影，这些细胞表达于所示酵母细胞中的内源性位点。箭头标记Mic60病灶形成的位置。(C类)在含有葡萄糖（左）和非发酵碳源glyercol（右）的培养基上连续稀释所示酵母细胞。比例尺：2μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.018
图6。
图6：复合物III和IV选择性地促进∆MICOS表型。
(A类)从所示菌株分离的洋地黄素固体线粒体的考马斯染色蓝色Native-PAGE凝胶。标签表示所示呼吸复合物和超复合物的近似大小。(B–C类)样品的凝胶内活性测定(A类)复杂IV活动(B)和ATP合成酶活性(C类). 分子量标记如左图所示。(D类)上图：考马斯染色的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶（BN-PAGE），是从指定菌株分离出的溶解DDM的线粒体。标签显示所示呼吸复合物的近似大小。底部：BN-PAGE分析后，SDS-PAGE进行二维和银染分析。分子量标记如左图所示。(E类)显示了表达mito-DsRed的指示酵母细胞的共焦荧光显微镜图像的Z投影。(F类)化学固定∆MICOS rho的典型电子显微镜图像0细胞。(G公司)图中显示了所示细胞线粒体形态的分类，如(E类). 对来自三个独立实验的大约75–100个细胞进行了量化，数据表示为平均值±SEM。∆MICOS细胞的数据从图1C中重新显示。比例尺：(E类)3微米；(F类)200纳米。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.019
图7。
图7.Mic19调节Mic60和Mic10/Mic12/Mic27子复合体之间的交互。
(A类)描绘通过质谱法从∆裂解物中识别的指示MICOS蛋白质的总光谱计数数的图表麦克风19用GFP抗体纯化Mic60-或Mic27-EGFP的野生型细胞。所示数据是两个独立实验的平均值和范围。(B)共聚焦荧光显微镜显示了∆的z投影图像麦克风19ρ+（左）和rho0（右）表达Mic60-EGFP的细胞MIC60话筒基因座和核分裂-DsRed。箭头标记Mic60的焦点定位。(C类)∆的共焦荧光显微镜图像显示了Z投影麦克风19表达mito-TagBFP以及Mic60-EGFP和Mic27-mCherry的细胞从其内源性位点表达。箭头表示Mic60和Mic27共定位的位点。(D类)0.4µm台阶至∆的单平面共焦荧光显微镜图像麦克风19在其内源性位点表达Mic60-EGFP和复合物III标记Qcr2-mCherry的细胞以及线粒体基质标记mito-TagBFP。箭头指示Mic60焦点的位置。(E类)如中所示(D类)表达Atp2-mCherry的细胞。(F类)MICOS及其组成子综合体的组织和角色的示意模型。该模型还描述了MICOS、心磷脂和呼吸复合物之间的相互关系，以及这些因素在生成线粒体内膜组织和嵴结构中的协调。比例尺：(B)3微米；(C类)2微米；(D类,E类)1微米。另请参见图7-图补充1-2和图7-源数据1。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.020
图7——图补充1。
图7：图补充1。∆中Mic60病灶形成不需要合成心磷脂麦克风19细胞。
表达丝裂原-DsRed和Mic60-EGFP的酵母细胞共焦荧光显微镜图像的Z投影，这些细胞表达于所示酵母细胞中的内源性位点。箭头标记Mic60病灶形成的位置。比例尺：2μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.022
图7——图补充2。
图7补充图2。Mic60组件位于嵴标记Qcr2和Atp2附近。
(A类–B)左：∆的单个通道和合并图像麦克风19表达mito-TagBFP以及Qcr2-mCherry和Mic60-EGFP的细胞在其内源性位点表达。右：左侧所示单元0.4µm步长的单平面图像。箭头指示Mic60焦点的位置。(C类–D类)如中所示(A类–B)表达Atp2-mCherry的细胞。的右侧面板(A类)和(C类)从图7D–E中重新显示。比例尺：1μm。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07739.023
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