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.2015年7月；35(13):2344-55.
doi:10.1128/MCB.01525-14。 Epub 2015年4月27日。

mTOR复合物2通过抑制其糖原合成酶激酶3依赖性和SCF-FBXW7介导的降解稳定Mcl-1蛋白

古俊晖 1, 平月 1, 邓兴明 2, 法德洛·R·库里 1, 孙世勇 三
附属公司

mTOR复合物2通过抑制其糖原合成酶激酶3依赖性和SCF-FBXW7介导的降解来稳定Mcl-1蛋白

古俊晖等。 分子细胞生物学. 2015年7月.

摘要

mTOR复合物2（mTORC2）通过未定义的机制调节细胞生存和生长。Mcl-1是一种Bcl-2家族蛋白，作为致癌蛋白发挥作用。mTORC2和Mcl-1稳定性之间的联系尚未建立，因此是本研究的重点。mTOR激酶抑制剂（TORkinase inhibitors，TORKinibs）通过敲除肥大鼠和敲除肥小鼠或Sin1而不是通过沉默猛禽来抑制这两种mTORC，从而降低癌细胞中的Mcl-1水平。TORKinib治疗和rictor敲除并没有改变Mcl-1 mRNA水平，反而降低了其蛋白质稳定性。此外，蛋白酶体抑制挽救了TORKinib诱导的Mcl-1减少。TORKinib持续增加Mcl-1的泛素化。因此，很明显，mTORC2的抑制增强了Mcl-1的降解，导致Mcl-1减少。糖原合成酶激酶3（GSK3）或FBXW7的抑制可挽救由TORKIIBS或rictor击倒诱导的Mcl-1减少。因此，mTORC2抑制明显通过GSK3依赖性和SCF-FBXW7介导的机制诱导Mcl-1降解。有趣的是，我们检测到mTORC2和SCF-FBXW7之间存在直接关联；TORKinib处理可以抑制这种关联，表明mTORC2可能直接与SCF-FBXW7复合物相关并抑制其，导致Mcl-1降解延迟。总之，我们的研究结果强调了mTORC2通过稳定Mcl-1调节细胞生存和生长的一种新机制。

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数字

图1
图1
TORKinibs可降低人非小细胞肺癌细胞系中Mcl-1的水平。（A） 用所示浓度（浓度）的TORKinibs处理A549细胞4 h。（B）用100 nM INK128处理所示细胞系不同时间，如所示。（C） 将对TORKinibs具有不同敏感性的所示NSCLC细胞系（下面板）暴露于100 nM INK128或AZD8055中4 h。在上述处理后，从这些细胞系制备全细胞蛋白裂解物，并进行Western blotting以检测所示蛋白。将细胞置于96周板中，并将其暴露于指定的TORKinib中3天后，用SRB法测定C组的生长曲线。数据是四次重复测定的平均值±标准偏差。LE，长时间接触；SE，短期接触；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。
图2
图2
rictor或Sin1而非raptor表达的遗传抑制（A到D）和异位rictor而非rapor的强制表达（E）改变了Mcl-1蛋白水平（A到E），但不改变其mRNA水平（F）。（A至E）从所示转染剂或MEF（A、C和D）、用所示siRNAs（B）转染48小时后的A549细胞和用含有给定基因（E）的质粒转染48 h后的293T细胞制备全细胞蛋白裂解物。然后对裂解液进行蛋白质印迹检测所示蛋白质。SE，短期接触。（F） 从所示MEF中制备总细胞RNA，然后进行RT-PCR，以检测Mcl-1和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）mRNA。Ctrl，control。
图3
图3
TORKinibs（A、B、F和G）或rictor击倒（C）对mTORC2的抑制不会改变Mcl-1 mRNA水平（A），而是促进Mcl-1蛋白降解（B到D），而rictor而非raptor的强制表达可以稳定Mcl-1（D和E）。（A） 用100 nM的DMSO或指示的TORKinibs处理A549细胞8 h。提取总细胞RNA，通过RT-PCR检测Mcl-1 mRNA水平。（B） 用DMSO或100 nM INK128或AZD8055处理A549细胞4 h。然后用PBS冲洗细胞三次，并用含有10μg/ml CHX的新鲜培养基重新培养。在指定的时间，收集细胞以制备全细胞蛋白裂解物并随后进行Western blot分析。用NIH ImageJ软件定量蛋白质水平，并将其归一化为微管蛋白。（C到E）将所示A549转染体暴露于10μg/ml CHX的不同时间（如所示（C））和293T细胞，在转染myc-rictor或HA-raptor后48 h，然后暴露于10微克/ml CHX不同时间（D和E），制备全细胞蛋白裂解物。然后对裂解产物进行Western blot分析。用NIH ImageJ软件对蛋白质水平进行定量，并将其标准化为微管蛋白。（F） 用10μM MG132预处理A549细胞1h，然后与指示的TORKIibs（INK128、AZD8055为100 nM，Torin 1和PP242为1μM）共处理4h。收集细胞用于制备全细胞蛋白裂解物和随后的Western blot分析。（G） 用HA-ubiquitin（Ub）转染H1299/Mcl-1细胞。48 h后，用10μM MG132预处理细胞40 min，然后与100 nM INK128共处理4 h。然后用抗Mcl-1抗体制备完整细胞蛋白裂解物用于IP，然后用所示抗体进行Western blotting（WB）。
图4
图4
用SB216763、CHIR99021或siRNA抑制GSK3可以挽救由TORKinibs（A到D）诱导的Mcl-1降解，并且Mcl-1的GSK3磷酸化对于TORKinabs（E和F）减少Mcl-1至关重要。（A和B）A549细胞用10μM SB216763或CHIR99021预处理30分钟，然后与指示的TORKinibs（100 nM用于INK128、AZD8055，Torin 1和1μM用于PP242）共处理10小时（A）或6小时（B）。（C） 将所示siRNAs转染A549细胞48小时，然后再将其暴露于100 nM INK128中4小时。在指定的时间，收获细胞以制备全细胞蛋白裂解物并随后进行蛋白质印迹分析。用NIH ImageJ软件定量蛋白质水平，并将其归一化为微管蛋白。（E） 将A549细胞暴露于100 nM INK128的不同时间，如图所示，然后收获用于制备全细胞蛋白裂解物和随后的Western blot分析。（F） 用携带指示基因的质粒转染293T细胞，48小时后，按照指示用100 nM TORKIIBs再处理10小时。在上述处理后，从这些细胞中制备全细胞蛋白裂解物，用于Western blotting检测指示的蛋白质。Ctrl，control。
图5
图5
通过敲除Cul-1和Skp1（A）或FBXW7（B和C）或敲除FBXW6（D和E）来抑制SCF-FBXW5，可以挽救由TORKIIBs（A到D）或rictor沉默（E）诱导的Mcl-1降低，而TORKIibs可以降低其他已知FBXW8底物（F）的水平。（A至C）用对照（Ctrl）或其他指示的siRNAs转染指示的细胞系，48小时后，将其暴露于指示的TORKinibs（100 nM）下额外4小时。（D）WT和FBXW7-KO HCT116细胞用指示的TOR Kinibs在100 nM下处理3小时。（E）用指示的siRNAs转染WT和FBXW7-KO HCT116细胞48小时。在这些处理后，收集细胞以制备全细胞蛋白裂解物并随后进行Western blotting。通过RT-PCR评估B组FBXW7的敲除效率。SE，短期接触。（F） 用100 nM的不同TORKinibs处理A549细胞8 h，然后收获用于制备全细胞蛋白裂解物和随后的Western印迹。
图6
图6
检测mTORC2和SCF-FBXW7复合物（a到E）之间的可能关联，以及mTORC1（F）对SCF-FBXW7介导的Mcl-1降解负调控的工作模型。（A） 用载体或Flag-FBXW7质粒转染293T细胞，48小时后，用100nM INK128处理2小时。（B和C）将A549细胞暴露于DMSO或100nM INK128中3小时。（D）将293T细胞与Flag-FBXW7和WT或突变体Mcl-1共转染48小时。（E）将293T细胞与myc-rictor和WT或突变Mcl-1共转染48 h。在上述转染或处理后，收集细胞以制备全细胞蛋白裂解物并随后进行IP-Western印迹（WB）检测所示蛋白。SE，短期接触；五、 向量；*，未撕裂的rictor带。（F） mTORC2对SCF-FBXW7介导的Mcl-1降解负调控的工作模型。GSK3依赖的Mcl-1在Ser159的磷酸化增强了Mcl-1与SCF-FBXW7复合物和mTORC2的关联；mTORC2的抑制（例如，使用TORKinib）有助于mTORC1从SCF-FBXW7复合物中分离，使SCF-FBXW7复合体通过泛素（Ub）-蛋白酶体（P）途径降解Mcl-1。
图7
图7
mTORC2的遗传（A到C）和药理（D到F）抑制增强了CDDP在抑制细胞生长（A、B、D和E）和诱导凋亡（C和F）方面的作用。（A和B）将指示的MEF暴露于指示浓度的CDDP中3天。然后用SRB分析估算细胞数量。数据是四次重复测定的平均值。误差条显示标准偏差。（C） 用不同浓度的CDDP处理显示的MEF 24小时，然后收获用于制备全细胞蛋白裂解物和随后的Western印迹。（D） 将所示细胞系接种到96个细胞培养板的孔中，并在第二天用所示浓度的CDDP单独、20 nM INK128或AZD8055单独（如箭头所示）或CDDP与INK128或者AZD80 55的组合处理3天。用SRB法估计细胞数量。数据是四次重复测定的平均值。误差条显示标准偏差。（E） 将所示细胞系以约400个/孔的密度接种到12孔板的孔中。第二天，用DMSO、20 nM INK128或AZD8055、0.5μM（H460）或1μM（A549）CDDP或CDDP加INK128或者AZD80 55处理细胞。10天后，用结晶紫染料对平板进行染色，以形成细胞集落，并用数码相机拍照。列显示了三次测定的平均值。误差条显示标准偏差。*，P（P）与所有其他治疗相比<0.001。（F） 将所示细胞系暴露于DMSO、20 nM INK128、2μM CDDP或CDDP加INK128中24或48小时。收集细胞以制备全细胞蛋白裂解物，然后进行Western blotting检测所示蛋白。cPARP，劈开的PARP；LE，暴露时间更长。
图8
图8
INK128和CDDP的联合用药在抑制非小细胞肺癌异种移植物（A和B）生长方面比单一用药更有效，而不会增加裸鼠的毒性（A）。H460异种移植物在分组后的同一天开始使用溶媒对照、INK128（每天口服0.5 mg/kg）、CDDP（每3天腹腔注射一次2 mg/kg）或INK和CDDP的组合进行治疗。如图所示，每2天测量一次肿瘤大小（A，上面板）和小鼠体重（A，下面板）。所提供的数据为平均值±标准误差。22天后，处死小鼠，取出肿瘤并称重（B）。*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）< 0.001; ****,P（P）<0.0001（与经车辆处理的对照组相比）。
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