Hepatocyte Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Reduced Oxidase 4 Regulates Stress Signaling, Fibrosis, and Insulin Sensitivity During Development of Steatohepatitis in Mice

doi:10.1053/j.gastro.2015.04.009

.2015年8月；149（2）：468-80.e10。

doi:10.1053/j.gastro.2015.04.009。 Epub 2015年4月14日。

肝细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶4在小鼠脂肪性肝炎发生过程中调节应激信号、纤维化和胰岛素敏感性

附属公司

¹加州大学戴维斯分校营养系。
²加利福尼亚大学戴维斯分校医学、胃肠病和肝病学系，加利福尼亚州萨克拉门托VA医学中心。
^三京都县医科大学，日本京都。
⁴瑞士日内瓦Genkyotex。
⁵德国法兰克福沃尔夫冈·歌德大学。
⁶伦敦国王学院英国心脏基金会中心，英国伦敦。
⁷加利福尼亚大学戴维斯分校医学、胃肠病和肝病学系，加利福尼亚州萨克拉门托VA医学中心。电子地址：njtorok@ucdavis.edu。

PMID： 25888330
预防性维修识别码：项目经理4516583
内政部： 10.1053/j.gastro.2015.04.009

肝细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶4在小鼠脂肪性肝炎发生过程中调节应激信号、纤维化和胰岛素敏感性

艾哈迈德·贝塔伊布等。胃肠病学. 2015年8月.

.2015年8月；149（2）：468-80.e10。

doi:10.1053/j.gastro.2015.04.009。 Epub 2015年4月14日。

附属公司

¹加州大学戴维斯分校营养系。
²加利福尼亚大学戴维斯分校医学、胃肠病和肝病学系，加利福尼亚州萨克拉门托VA医学中心。
^三京都县医科大学，日本京都。
⁴瑞士日内瓦Genkyotex。
⁵德国法兰克福沃尔夫冈·歌德大学。
⁶伦敦国王学院英国心脏基金会中心，英国伦敦。
⁷加利福尼亚大学戴维斯分校医学、胃肠病和肝病学系，加利福尼亚州萨克拉门托VA医学中心。电子地址：njtorok@ucdavis.edu。

PMID： 25888330
预防性维修识别码：项目经理4516583
内政部： 10.1053/j.gastro.2015.04.009

摘要

背景和目标：活性氧化物质（ROS）被认为与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的进展有关。然而，人们对肝细胞中活性氧的来源及其在疾病进展中的作用知之甚少。我们研究了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶4（NOX4）对NASH患者和脂肪性肝炎小鼠肝组织的影响。

方法：来自加利福尼亚大学戴维斯癌症中心生物资源库的5名NASH患者、4名单纯脂肪变性患者和5名非脂肪变性患者（对照组）的肝活检样本。患有肝细胞特异性NOX4（NOX4，hepKO）和NOX4的C57BL/6小鼠（对照组）被给予快餐饮食（补充高果糖玉米糖浆）或胆碱缺乏型l-氨基酸定义饮食，诱导脂肪性肝炎，或对照饮食，持续20周。另一组小鼠被给予NOX4抑制剂（GKT137831）。收集肝组织并进行免疫印迹分析，以确定NOX4水平、炎症和纤维化标志物、双链RNA活化蛋白激酶和磷酸化eIF-2α激酶介导的应激信号通路。我们进行了高胰岛素-血糖钳夹研究和免疫沉淀分析，以确定PP1C的氧化和磷酸酶活性。

结果：与对照组相比，NASH患者的NOX4水平升高。肝细胞特异性NOX4缺失降低了饮食诱导脂肪性肝炎小鼠的氧化应激、脂质过氧化和肝纤维化。NOX4小分子抑制剂可降低饮食诱导脂肪性肝炎小鼠的肝脏炎症和纤维化，并提高胰岛素敏感性。在原代肝细胞中，NOX4降低了磷酸酶PP1C的活性，延长了双链RNA活化蛋白激酶的激活和细胞外信号调节激酶介导的应激信号的磷酸化。NOX4肝细胞特异性缺失小鼠和给予GKT137831的小鼠的胰岛素敏感性增加。

结论：NOX4调节肝脏中的氧化应激，其水平在NASH患者和饮食诱导性脂肪性肝炎小鼠中升高。NOX4抑制剂可减轻肝脏炎症和纤维化，增加胰岛素敏感性，可能用于NASH的治疗。

关键词：炎症；小鼠模型；肥胖；压力信号。

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数字

图1
NOX4在患者和两种NASH饮食动物模型中上调。(A类)RT qPCR和(B类)免疫组织化学检测NASH患者、单纯脂肪变性患者和健康对照组的肝活检样本。（数据表示健康对照组的折叠值，设置为1，平均值±SEM，N=5。对于纤维化阶段为2-3的NASH患者，*p＜0.05）。(C类)对来自快餐饮食（FFD），以及(D类)典型的western blot显示NOX4FFD喂养小鼠的诱导。密度测定、折叠咀嚼控制、，（*p<0.05）。(E类)CDAA饮食模型中NOX4的诱导（倍喂食食物的小鼠的超控制值，N=5，*p<0.05）。比例棒：200μm，插入刻度：50μm。

图2
肝细胞中NOX4的缺失可减轻氧化应激、脂质过氧化、，快餐饮食小鼠的炎症和细胞凋亡。(A类)血清NOX4中的ALT显著降低^hepKO公司FFD上的小鼠（对于每个基因型和饮食）。(B类)用荧光素评估氧化自由基含量显著下降（表现为折叠对照，N=5），并且(C类)NOX4的脂质过氧化作用也减弱^hepKO公司老鼠（MDA测定，折叠对照，N=5）。(D类)的表达式TNF-α、MCP1和Il-1β在氮氧化物4^hepKO公司小鼠（折叠对照，N=5）。(E类)细胞凋亡通过免疫染色评估肝组织中活性caspase 3亚单位NOX4显著降低^hepKO公司小鼠（在每个样品，折叠对照，N=5）。数值表示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。WT表示同窝出生*飞行/飞行*对照，bar=200μm。

图3
NOX4肝纤维化减少^hepKO公司吃快餐的老鼠（FFD）。(A类)羟脯氨酸的含量在氮氧化物4^hepKO公司FFD上的小鼠（每组5只），以及(B类)通过苦苷红染色观察并通过图像J分析定量的纤维化也减少了（代表性图像，N=5）。的表达式(C类)前胶原α1（I）(D类)αSMA和(E类)RT-qPCR评估的TGF-β在氮氧化物4^hepKO公司小鼠（每组5只）。值表示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01。WT表示室友*飞行/飞行*对照，bar=200μm。

图4
GKT137831处理的快餐饮食可减轻肝纤维化和炎症（FFD）喂食小鼠。用GKT137831或来自12周饮食中的第6周。（N=5/组）。(A类)谷丙转氨酶(B类)治疗组小鼠TNF-α、MCP1和Il-1β的表达降低使用抑制剂。(C类)苦味酸红染色，以及(D类)对前胶原αl（I）、αSMA和TGF-β的评估显示出显著性改善纤维化。(E类)总糖和胰岛素耐受性试验经抑制剂处理的小鼠（veh：载体，inh：抑制剂*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图5
氮氧化物4^hepKO公司保护小鼠免受应激信号和快餐饮食中的细胞凋亡。典型的western blot图像描绘双链RNA活化蛋白激酶（PKR）的磷酸化和活化，PERK、其下游靶点eIF2α、CHOP、JNK1/2和caspase 3在*飞行/飞行*，和NOX4^hepKO公司老鼠。密度分析，数据为表示为折叠对照（非磷酸化或前摄物3值），N=5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图6
棕榈酸酯介导的原代肝细胞NOX4诱导导致PP1c磷酸酶活性。(A类)进行荧光素酶启动子分析用pGL-hNOX4-Luc转染原代肝细胞；用Ad-GFP转换或Ad-DNSmad3，并将其暴露于棕榈酸BSA（200μM）中。同时，启动子在TGFβ1（已知NOX4转录调节因子）中进行检测，±DNSmad3转导的肝细胞。棕榈酸酯处理导致DNSmad3降低的启动子活性的诱导。（N=4，p<0.05）。(B类)油酸（OA，200μM）未诱导NOX4启动子活性（N=4）。重量(*飞行/飞行*)和NOX4−/−肝细胞暴露于棕榈酸酯-BSA(C类)mRNA和(D类)蛋白质水平在NOX4−/−细胞和半胱天冬酶3激活减弱（RT-qPCR的N=4和western blot）。油酸没有诱导CHOP和caspase 3激活。(E类)免疫沉淀后研究PP1c的磷酸酶活性来自棕榈酸酯暴露的初级*飞行/飞行*肝细胞存在或缺乏谷胱甘肽（GSH）或H2O2；或在NOX4−/−的肝细胞中老鼠。PP1c的活性在*飞行/飞行*细胞用谷胱甘肽恢复的棕榈酸酯处理。用H2O2处理也会导致磷酸酶活性显著下降。PP1c活性没有降低在NOX4中进行棕榈酸酯处理后^-/-肝细胞（NT：不治疗，N=4）。（Ctr-Ad:Ad-GFP，值表示为折叠控制，平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01）。

图6
棕榈酸酯介导的原代肝细胞NOX4诱导导致PP1c磷酸酶活性。(A类)进行萤光素酶启动子测定用pGL-hNOX4-Luc转染原代肝细胞；用Ad-GFP转换或Ad-DNSmad3并将其暴露于棕榈酸酯-BSA（200μM）中。同时，启动子在TGFβ1（已知NOX4转录调节因子）中进行检测，±DNSmad3转导的肝细胞。棕榈酸酯处理导致DNSmad3降低的启动子活性的诱导。（N=4，p<0.05）。(B类)油酸（OA，200μM）未诱导NOX4启动子活性（N=4）。重量(*飞行/飞行*)和NOX4−/−肝细胞暴露于棕榈酸酯-BSA(C类)mRNA和(D类)蛋白质水平在NOX4−/−细胞和半胱天冬酶3激活减弱（RT-qPCR的N=4和western blot）。油酸不诱导CHOP和胱天蛋白酶3的活化。(E类)免疫沉淀后研究PP1c的磷酸酶活性来自棕榈酸酯暴露的初级*飞行/飞行*肝细胞存在或缺乏谷胱甘肽（GSH）或H2O2；或在NOX4−/−的肝细胞中老鼠。PP1c的活性在*飞行/飞行*细胞用谷胱甘肽恢复的棕榈酸酯处理。用H2O2处理也会导致磷酸酶活性显著下降。PP1c活性没有降低在NOX4中棕榈酸盐处理后^-/-肝细胞（NT：不治疗，N=4）。（Ctr-Ad:Ad-GFP，值表示为折叠对照，平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01）。

图7
NOX4中胰岛素敏感性和信号传导得到改善^hepKO公司老鼠在快餐饮食。（自由流动日）(A类)葡萄糖（GTT）和(B类)胰岛素进行了耐受性试验（ITT），NOX4^hepKO公司小鼠的情况有所改善与wt相比的整体胰岛素敏感性(*飞行/飞行*)控制（N=5对于每组，AUC：曲线下面积，值表示为折叠控制，平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01）。(C类)*飞行/飞行*或NOX4^hepKO公司FFD上的老鼠给予胰岛素，并进行免疫沉淀/免疫印迹以评估IR、IRS-1和western blots检测Akt磷酸化。IR、IRS-1和Akt的磷酸化NOX4改进^hepKO公司小鼠与*飞行/飞行*老鼠（代表性斑点，N=4，密度测定，数值表示为折叠对照组，平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01）。**(D类)**JNK1KO肝细胞中NOX4诱导减少IRS1公司^泰尔608和Akt^序列473胰岛素的磷酸化反应与对照载体转导细胞相比。Wt或JNK1KO原代肝细胞用Ad-GFP或Ad-NOX4转导24小时，然后暴露于100nM胰岛素和IRS-1免疫沉淀和印迹用于IRS^轮胎608.Akt-western印迹检测pAKT^第473页.高胰岛素-血糖钳夹研究是如补充图8所示。

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