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.2015年5月；33(5):495-502.
doi:10.1038/nbt.3192。 Epub 2015年4月13日。

单细胞基因表达数据的空间重构

拉胡尔·萨蒂亚 1, 杰弗里·法雷尔 2, 大卫·根纳特 1, 亚历山大·席尔 三, 阿维夫·雷格夫 4
附属公司

单细胞基因表达数据的空间重构

拉胡尔·萨蒂亚等。 Nat生物技术. 2015年5月.

摘要

空间定位是细胞命运和行为的关键决定因素，但缺乏跨复杂组织进行空间解析、转录全基因表达谱分析的方法。RNA染色方法只检测少量转录物，而测量全局基因表达的单细胞RNA-seq将细胞与其自然空间环境分离。在这里，我们提出了Seurat，一种通过整合单细胞RNA-seq数据和原位RNA模式来推断细胞定位的计算策略。我们应用修拉对分离的斑马鱼（Danio rerio）胚胎中的851个单细胞进行了空间定位，并生成了空间模式的转录宽图。我们使用几种实验方法确认了修拉的准确性，然后使用该策略识别一组原型表达模式和空间标记。修拉正确定位了罕见的亚群，准确绘制了空间受限和分散的群。Seurat将适用于绘制不同系统中复杂图案组织内的细胞定位图。

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数字

图1
图1。修拉概述
作为输入，Seurat获取单细胞RNA-seq数据(1，左）来自分离的细胞(例如，单元格A–C），其中有关原始空间上下文的信息在分离过程中丢失，以及(2，右侧）就地一系列标志性基因的杂交模式。为了生成二进制空间参考地图，感兴趣的组织被划分为一组离散的用户定义的箱子就地如基因X、Y和Z所示，数据被二值化以反映每个箱子内的基因表达检测(三)Seurat使用多个相关基因的表达测量来改善标志性基因个体测量中的随机噪声。如图所示，修拉基于数据集中的其他可变基因学习每个标志性基因的基因表达模型，减少了对单一测量的依赖，并减轻了技术错误的影响。修拉然后建立每个箱子中基因表达的统计模型(4)通过将RNA-seq估计的双峰表达模式与二进制化的就地数据。所示为基因X、Y和Z在三种不同胚胎箱中的概率分布。最后，修拉使用这些模型推断细胞的原始空间位置(5)，将起源的后验概率（以紫色阴影表示）指定给每个箱子。修拉可以专门映射到一个箱子(例如，单元格C），或在某些情况下将概率分配给多个箱子(例如，单元格A和B）。
图2
图2。斑马鱼胚胎的单细胞RNA-seq
（a） 斑马鱼胚胎50%外胚层的卡通示意图，描绘了细胞层（包膜层，EVL；深层细胞层，DEL；卵黄合胞层，YSL）、重要结构（胚胎边缘）和两个主要空间轴（动物-植物和背-腹）。（b） 为了创建空间参考地图，我们使用了47种颜色就地杂交模式(即，“标志性”基因），之前发表在科学文献中。我们将胚胎细分为64个容器，并使用就地从侧面和动物的角度来看。此处显示的是就地对于ta/无尾及其生成的二进制表示。（c） 在胚胎解剖后，将单个细胞分离、电镀并挑选到微量滴定板中，并使用修改后的单细胞RNA-seq协议进行剖面分析，该协议包括独特的分子指数(方法).
图3
图3。修拉正确推断细胞的空间位置
（a） Seurat绘制了整个胚胎的细胞图，与组织的随机分离一致。所示为随机分离细胞的细胞质心。（b） 使用修改后的方案制备少量细胞，以消耗动物帽（垃圾箱第6-8排）(补充电影2)，Seurat在对这些细胞的映射中捕捉到了这种消耗。图中显示了沿边缘到动物轴（X轴，如箱）的随机分离细胞和动物耗尽细胞之间定位百分比（Y轴）的折叠变化。（c） 在解剖显微镜下手动采集少量“参考”细胞，以便估计其原始空间位置(补充电影3). 由于在50%的外周背腹侧规格在形态学上不明显，因此使用一簇先前移植的荧光细胞作为基准标记来追踪细胞的来源，并在屏蔽期背腹轴变得明显时推断细胞的位置(方法). （d–e）使用“参考”细胞评估修拉。（d） Seurat推断参考细胞位置的代表性示例（质心：绿色，后验概率：紫色阴影，最强颜色代表100%后验概率）与实验注释位置（粉红色）。胚胎边缘也用卡其色描绘。用较大的半径绘制实验注释球体，以反映实验测量的置信度。（e） 参考单元格的推断位置和测量位置之间的距离误差直方图。中位误差为2个区间，在动物-植物轴和背腹轴之间平均分配。（f） 对于每个标志性基因，我们从输入参考图中删除该基因，然后重新导入其就地来自修拉空间模式的模式。所示为与二进制输入模式（顶部）和ROC得分（底部）进行比较的代表性示例（中间）。（g–h）推断地标准确性的ROC分析在现场与二进制输入模式的比较（ROC中值=0.96）。
图4
图4。通过空间聚类发现的九种原型模式
（a） 我们基于修拉的空间映射计算了290个高变异基因的插补表达模式(方法). 然后通过输入的空间定位对基因进行聚类(补充图5)分为9个广泛描述多基因模式的“原型”：RM，局限于边缘；VM，腹缘；DEM，背面富集边缘；DRM，反向限制保证金；EM，扩展裕度；五、 腹侧；DA，背侧动物；VA，腹侧动物；A、 动物。（b） 从尚未发表的各种原型中选择基因（于2014年9月4日评估），50%外显表达模式，然后通过RNA分析就地杂交。自上而下：修拉预测的表情模式就地（背向右侧）和动物帽视图就地（背对右侧）。如正文所述，实验确定的模式与修拉的预测高度一致。基因通过黑线与它们聚集的原型相连。比例尺代表200µ米。
图5
图5。修拉识别并表征罕见的细胞群
（a） 这幅漫画描绘了前索板祖细胞（绿色）聚集在背缘，内胚层祖细胞（蓝色）散布在胚胎边缘。（b） 经典内胚层标记表达分布的小提琴图(sox32型,cxcr4a型)，经典的赤道前板块标记(全球供应链)和新提出的弦前板标记(波纹1)在PCA分析确定的细胞群中：所有边缘细胞（“边缘”）、内胚层祖细胞（“内胚层”）和索前板祖细胞（”PCP“）。（c） Seurat将内胚层祖细胞（蓝色）和前激素板祖细胞（绿色）定位到它们的特征位置。（d） 修拉的预测表达模式（左）和就地表达式的验证（右）波纹1一种新的弦前板标记。（e） 双精度就地对于全球供应链（橙色）和波纹1（蓝色）确认波纹1在索前板祖细胞中表达。（f） 整个胚胎的PCA显示了一组以前没有特征的细胞（品红色），以PC4区分，并表达高水平的基因，这些基因是细胞凋亡的标志。（g） Seurat预测的这些“凋亡样”细胞（洋红）的定位分散在胚胎周围，但向动物极点富集。（h） 小提琴图的表达分布是g15和mat2al公司、所有细胞和假定凋亡样细胞中“凋亡样”群体的标记。（i）现场凋亡样细胞的四个标记物的杂交以类似的分散模式表达。顶部：侧视图，底部：动物极点视图。（j） 双荧光灯就地杂交aplnrb公司（品红色）和是g15（绿色）显示，正如修拉预测的那样，这些标记是共同表达的。值得注意的是，细胞似乎表达高水平的aplnrb公司或是g15另一种基因水平较低。比例尺代表100µ米。
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中的注释

  • RNA：把转录组学放在它的位置上。
    伯吉斯DJ。 伯吉斯DJ。 Nat Rev基因。2015年6月；16(6):319. doi:10.1038/nrg3951。Epub 2015年5月7日。 Nat Rev基因。2015. PMID：25948245 没有可用的摘要。

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