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.2015年5月15日；290(20):12744-52.
doi:10.1074/jbc。M115.641118。 Epub 2015年3月31日。

磷脂酰丝氨酸脱羧酶1的自动催化和功能不需要线粒体特异性因子

欧马·翁古卡 1, 伊丽莎白·卡尔扎达 1, Oluwaseun B Ogunbana奥卢瓦森B 1, 史蒂芬·M·克莱普 2
附属公司

磷脂酰丝氨酸脱羧酶1的自动催化和功能不需要线粒体特异性因子

欧马·翁古卡等。 生物化学杂志. .

摘要

磷脂酰乙醇胺（PE）是一种主要的细胞磷脂，可以通过四种不同的途径生成，其中一种存在于线粒体中。产生PE的线粒体酶是磷脂酰丝氨酸脱羧酶1（Psd1p）。Psd1p产生的PE池无法通过其他细胞PE代谢途径进行补偿，对许多线粒体功能（包括氧化磷酸化和线粒体动力学和形态）非常重要，并且对小鼠发育至关重要。为了变得具有催化活性，Psd1p经历了一个自催化处理步骤，涉及一个保守的LGST基序，该基序将酶分离成α和β亚基，这些亚基保持非共价连接，并通过膜嵌入的β亚基锚定在内膜上。据推测，Psd1p的自催化需要线粒体特异性因子，而Psd1p要在体内发挥作用，必须在线粒体内膜中嵌入正确的拓扑结构。然而，Psd1p自动催化所需的线粒体因子的身份尚未确定。为了定义Psd1p自催化的分子需求，我们证明：1）尽管LGST基序从细菌到人类都是保守的，但只有丝氨酸残基对Psd1p自催化和功能是绝对必要的；2） 酵母Psd1p不需要底物磷脂酰丝氨酸进行自催化；和3）与之前的报告相反，酵母Psd1p的自催化不需要线粒体特异性磷脂、蛋白质或辅因子，因为Psd1p直接进入分泌途径通常会经历自催化，并且在体内完全发挥作用。

关键词：自催化；膜；膜生物发生；线粒体；磷脂酰乙醇胺；磷脂；酵母。

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数字

图1。
图1。
只有保守LGST基序的丝氨酸残基对酵母Psd1p的自动催化和功能是必需的。 A、，指示物种Psd的Clustal Omega序列比对。灰色方框突出了保守的LGST基序。星号表示相同的残留物。单点表示保守程度较低的残留物，以及双点表示高度保守的残基。B、 psd1级Δpsd2型Δ酵母（−）和psd1级Δpsd2型用指示的Psd1p结构转化的Δ酵母在合成全葡萄糖中培养过夜(SCD公司)补充2m的介质米乙醇胺。免疫印迹法检测全细胞提取物中Psd1p的α和β亚基；Tom70p用作加载控件。C、 psd1级Δpsd2型Δ酵母（−）和psd1级Δpsd2型用指示的Psd1p构建体转化的Δ酵母被点到SCD板上±2 m米乙醇胺，并在30°C下孵育48小时。D中，线粒体是从psd1级Δ酵母（−）和psd1级在富含乳酸的培养基中用指示的Psd1p结构转化的Δ酵母。线粒体在指定温度下与NBD-PS孵育40分钟，并通过TLC分离磷脂。Psd活性测定为每毫克线粒体每分钟形成的NBD-PE量（平均值±S.E。，n个= 6). 用TLC分离10 nmol NBD-PS和NBD-PE作为迁移标准。使用Student’st吨测试。这个星号表明与psd1级Δ (−).NS公司，相对于而言不显著psd1级Δ (−).
图2。
图2。
Psd1p的自催化加工不需要其底物或线粒体特异性磷脂。 A、，示意图显示了PS和CL生物合成途径中的亚细胞定位和遗传靶向步骤。CDP-DAG公司，胞苷二磷酸二酰甘油；化学机械抛光，胞苷单磷酸；G3P公司，3-磷酸甘油；PGP公司，磷脂酰甘油磷酸盐。B中，所示酵母菌株在YPD中培养过夜，添加10μCi/ml32P（P）我放射标记线粒体磷脂，提取后用TLC分离。PA公司，磷脂酸；圆周率磷脂酰肌醇。C、，在YPD中生长过夜后，通过免疫印迹分析指示菌株的全细胞提取物中的Psd1p；Aco1p和Aac2p用作加载控制。这个星号指示与抗体反应的非特异性条带。
图3。
图3。
ER靶向Psd1p发生自催化在体外. A、，的示意图在体外Psd1和CPY*mPsd1构造。MTS公司线粒体靶向序列；TM（TM）跨膜结构域；CPY公司羧肽酶Y的ER靶向信号；NXS公司，已插入N个-糖基化信号。B、 在体外的导入[35S] 在IM上质子动力存在（+ΔΨ）或不存在（-Δψ）的情况下，蛋氨酸标记的Psd1或CPY*mPsd1进入wt线粒体。用胰蛋白酶去除非进口前体。分析了每个前体（−）的5%和每个时间点的100%。P（P），前体；我，进口中间体；米，成熟β亚单位。C、，Psd1或CPY*mPsd1为[35S] 蛋氨酸标记在体外在没有（−）或（+）犬胰腺微粒体的情况下。采集微粒体膜并进行模拟处理(M（M）)或用EndoH治疗（+）。对于CPY*mPsd1，糖基化(+首席人事官)和脱糖基化（−首席人事官)前驱体(P（P）)β亚基。在B类和C类，的箭头指示自催化后α亚基的位置。D中，一张示意图，描绘了嵌入微粒体中的自动催化处理CPY*mPsd1的拓扑结构。附加的未成熟N个-描述了聚糖。
图4。
图4。
将Psd1p重新定向到ER体内. A、，的示意图体内Psd1和CPY*mPsd1构造。MTS公司线粒体靶向序列；TM（TM）跨膜结构域；CPY公司羧肽酶Y的ER靶向信号；NXS公司，插入N-糖基化信号。B、，亚细胞组分由psd1级Δpsd2型Δ酵母（−）和psd1级Δpsd2型Δ酵母通过一系列差速离心，转化为在YPD中生长的Psd1或CPY*mPsd1。用SDS-PAGE对每一组分的30微克进行分离，并对Psd1p的两个亚单位（α和β）和以下细胞器标记进行免疫印迹；Qcr6p（线粒体）、Sec62p（ER）和Hsp70p（胞浆）。C、，全细胞提取物psd1级Δpsd2型用生长在YPD中的Psd1或CPY*mPsd1转化的Δ酵母在37°C下模拟处理（M）或用EndoH处理（+）4h。免疫印迹法检测Psd1p的β和α亚基，Aac2p作为负荷对照。对于CPY*mPsd1，糖基化(+首席人事官)和去糖基化的（−首席人事官)β亚基被指示。
图5。
图5。
指向ER的Psd1p功能正常体内. A、，线粒体（图4中的P13PB类)和来自wt酵母（wt）的微粒体（P40）级分，屏蔽门1Δ酵母，psd1级Δpsd2型Δ酵母（−），以及psd1级Δpsd2型用生长在YPD中的Psd1或CPY*mPsd1转化的Δ酵母与NBD-PS在指定温度下培养40分钟。提取脂质，用TLC分离，用PharosFX成像仪检测NBD标记的物种。B、，线粒体和C、，测定微粒体Psd活性（平均值±S.E。，n个= 3). 通过单向方差分析确定显著差异(psd1级Δpsd2型Δ与Psd1p或CPY*mPsd1相比psd1级Δpsd2型Δ（−））或学生的t吨测试（30与4°C；重量与psd1相比Δ).D中，用免疫印迹法分析从YPD过夜培养的指示菌株中提取的全细胞提取物中Psd1p的β和α亚基；Pic1p用作加载控件。E、，指示菌株被发现在SCD±2 m上米乙醇胺，并在30°C下生长3天。
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