Establishment and characterization of rat portal myofibroblast cell lines

doi:10.1371/journal.pone.0121161

.2015年3月30日；10（3）：e0121161。

doi:10.1371/journal.pone.0121161。 2015年电子收集。

大鼠门静脉肌成纤维细胞系的建立及鉴定

米歇尔·福斯特尔¹, 杰西卡·戈里¹, 埃利塞·G·拉沃伊¹, 艾丽西娅·格雷厄姆², 让·塞维尼^三, 乔纳森·德拉诺夫¹

附属公司

¹美利坚合众国阿肯色州小石城阿肯色大学医学科学系胃肠病和肝病科；美国阿肯色州小石城中阿肯色VA医疗保健系统研究服务部。
²美利坚合众国阿肯色州小石城阿肯色大学医学科学院胃肠病和肝病科。
^三加拿大魁北克拉瓦尔大学医学院微生物感染与免疫学教研室；魁北克大学研究中心，加拿大QC。

PMID： 25822334
预防性维修识别码：项目经理4378927
内政部： 10.1371/journal.pone.0121161

大鼠门静脉肌成纤维细胞系的建立及鉴定

米歇尔·福斯特尔等。公共科学图书馆综合版. 2015.

.2015年3月30日；10（3）：e0121161。

doi:10.1371/journal.pone.0121161。 2015年电子收集。

作者

米歇尔·福斯特尔¹, 杰西卡·戈里¹, 埃利塞·G·拉沃伊¹, 艾丽西娅·格雷厄姆², 让·塞维尼^三, 乔纳森·德拉诺夫¹

附属公司

¹美利坚合众国阿肯色州小石城阿肯色大学医学科学院消化与肝病科；美国阿肯色州小石城中阿肯色VA医疗保健系统研究服务部。
²美利坚合众国阿肯色州小石城阿肯色大学医学科学院胃肠病和肝病科。
^三加拿大魁北克拉瓦尔大学医学院微生物感染与免疫学教研室；加拿大魁北克省魁北克CHU中心。

PMID： 25822334
预防性维修识别码：项目经理4378927
内政部： 10.1371/journal.pone.0121161

摘要

肝纤维化过程中瘢痕形成肌成纤维细胞的主要来源是活化的肝星状细胞（HSC）和门静脉成纤维细胞（PF）。与特征鲜明的HSC相比，PF仍然缺乏研究，定义也不明确。这主要是因为在功能研究中分离啮齿动物PF在技术上具有挑战性，并且尚未建立PF细胞系。为了解决这个问题，我们生成了两个多克隆门静脉肌成纤维细胞系RGF和RGF-N2。RGF和RGF-N2是从成年大鼠肝脏分离的初级PF中建立的，这些PF经过培养活化和随后的SV40介导的永生化。具体而言，Ntpdase2/Cd39l1分选的初级PF用于生成RGF-N2细胞系。通过RT-PCR、免疫荧光、免疫印迹和基于溴脱氧尿苷的增殖测定对两种细胞系进行了功能表征。首先，永生化RGF和RGF-N2细胞的表型肌成纤维细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原α-1、金属蛋白酶组织抑制剂-1、PF特异性标记物弹性蛋白、XV型胶原α1和Ntpase2/Cd39l1以及间充质细胞标记物ecto-5'-核苷酸酶/Cd73呈阳性，而HSC特异性标记物结蛋白和卵磷脂视黄醇酰基转移酶为阴性。其次，RGF和RGF-N2细胞系都可以使用标准方法进行转染。最后，RGF和RGF-N2细胞在共同培养中抑制Mz-ChA-1胆管癌细胞的生长，如先前对原代PF的研究所示。永生大鼠门静脉肌成纤维细胞RGF和RGF-N2的细胞系表达活化PF衍生肌成纤维的典型标记，适合DNA转染，并能有效抑制胆管细胞增殖。RGF和RGF-N2细胞系均为门静脉（myo）成纤维细胞的功能研究及其对肝纤维化进展的贡献提供了新的体外细胞模型。

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利益冲突声明

竞争利益：作者确认，从商业来源“Gilead Sciences Research”获得的资金不会改变对PLOS ONE数据和材料共享政策的遵守。

数字

**图1。RT-PCR对永生大鼠门静脉成纤维细胞RGF和RGF-N2细胞系的表型特征。**
（A）将培养的初级分离aPF（8天）和永生大鼠PF RGF和RGF-N2 cDNA样品作为PCR反应的模板，使用针对肝肌成纤维细胞中几个成纤维基因转录本的引物（基因列表和登录号见表1）。RGF和RGF-N2细胞系表达经典的αSMA(*学报2*)，I型胶原蛋白α1(*第1列*α1)肝脏肌成纤维细胞基因产物，以及PF衍生的弹性蛋白(*埃尔恩*)，XV型胶原蛋白α1(*第15列*α1)和Ntpdase2(*Entpd2型*)在原代培养激活的门静脉肌成纤维细胞中也发现了肌成纤维蛋白标记物。两种细胞系均缺乏HSC衍生的肌成纤维细胞结蛋白(设计)和卵磷脂-视黄醇酰基转移酶(拉特)标记。当未检测到PCR扩增子（未显示）时，使用大鼠正常肝脏或大脑cDNA作为阳性对照。使用无核酸水作为阴性对照（未显示）。兆瓦,*分子量；英国石油公司*,*碱基对*（B）培养的原代分离aPF（8天，2次原代细胞分离）和永生化大鼠PF RGF（第61和64代）和RGF-N2 cDNA（第54和55代）样品被用作定量PCR反应的模板，探针针对成纤维细胞转录物*学报2*,*埃尔恩*,*第1列*α1,*Entpd2型*、和*Nt5e号*肝肌成纤维细胞中的基因。家务*200万*和*Hprt1型*基因被单独用作参考。

**图2。免疫印迹法研究永生大鼠门静脉成纤维细胞RGF和RGF-N2细胞系的表型特征。**
（A）分析永生化大鼠PF RGF和RGF-N2蛋白样品的Gfap和细胞角蛋白的表达。Housekeeting Gapdh蛋白作为负荷对照，Mz-Cha-1细胞裂解物作为细胞角蛋白表达的阳性对照，HSC-T6细胞裂解物用作Gfap表达的阳性控制。RGF（通道#59，1^标准34号车道和2号通道^第车道）和RGF-N2（通道#52，1^标准25号车道和2号通道^第lane）细胞既不表达细胞角蛋白也不表达Gfap蛋白（后者传代45代后）。（B）分析永生大鼠PF RGF和RGF-N2蛋白样品的αSMA、Elastin、Pdgfrβ和Egfr的表达。RGF和RGF-N2表达所有测试蛋白。家政Gapdh蛋白用作负荷控制。千帕,*千道尔顿*.

**图3。免疫荧光法检测永生化大鼠门脉成纤维细胞RGF和RGF-N2细胞系的表型特征。**
将永生RGF细胞固定，用PF衍生肌成纤维细胞特异表达蛋白的抗体染色，并用DAPI核标记染料进行复染。RGF细胞表达肌纤维母细胞特异性αSMA和Cd73蛋白、PF特异性弹性蛋白和Ntpase2蛋白、β-肌动蛋白和SV40抗原。固定永生RGF-N2细胞，用相同的抗体染色，并用DAPI染料进行复染，如上所述。与RGF细胞一样，RGF-N2细胞表达αSMA、Cd73、Elastin、Ntpase2、β-actin和SV40抗原。*400倍放大*.

**图4。免疫荧光法在永生大鼠门静脉成纤维细胞RGF和RGF-N2细胞系中的质粒DNA转移。**
使用Fugene6转染试剂将编码单体GFP蛋白cDNA的表达载体转染RGF和RGF-N2细胞。在共焦显微镜成像之前，将转染细胞固定并用DAPI染料进行复染。两种细胞株均显示绿色荧光信号，表明重组GFP蛋白表达。*放大200倍*.

**图5。通过溴脱氧尿苷掺入试验，将Mz-Cha-1胆管细胞与永生大鼠门静脉成纤维细胞RGF和RGF-N2细胞系共培养。**
在评估溴脱氧尿苷掺入之前，用溴脱氧尿试剂标记亚融合的人Mz-Cha-1胆管细胞24小时（第1天），并与RGF和RGF-N2细胞共同培养额外24小时（第一天）。两个RGF(****+*RGF公司*:*M=50*.11,*SE=3*.899,与.单独地:*M=100*,*SE=22*.76,p˂.0001，n=4）和RGF-N2(****+RGF-N2型:*M=37*.64,*SE=13*.40与.单独地:*M=100*,*SE=22*.76,p˂.0001，n=4）细胞系能够抑制胆管细胞的增殖。

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[6] Lemoinne S、Cadoret A、El Mourabit H、Thabut D、Housset C.肝肌成纤维细胞的起源和功能。Biochim生物物理学报。2013; 1832: 948–954. 10.1016/j.bbadis.2013.02.019-内政部-公共医学

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[10] Dranoff JA，Wells RG。门静脉成纤维细胞：未被充分认识的胆道纤维化介质。肝病学。2010; 51: 1438–1444. 10.1002/hep.23405-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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